Nos gustaría agradecer a profesor Anders Jeppsson por ayuda con el abastecimiento de los vasos sanguíneos utilizados en los experimentos. Este estudio fue financiado por la subvención de LUA ALF para SSH.

El tejido utilizado, y el protocolo de este trabajo sigue las directrices éticas de la Universidad de Gotemburgo.
1. almacenamiento y preparación de tejido
<ol><li>Cortar el tejido circundante de la vena safena obtenido usando tijeras y pinzas quirúrgicas. Nota: Se diseca la vena safena de la extremidad inferior de seres humanos por cirujanos vasculares. La vena safena utilizada en este trabajo es una parte no utilizada después de la cirugía de bypass.</li>
	<li>Para evitar fugas durante la perfusión, ligar todas las ramas de lado en sus extremos con suturas y pinzas.</li>
	<li>Mantener la vena en un tubo de 50 mL que contiene 40 mL de solución salina buffer fosfato (PBS). Lavar la vena cambiando PBS 2 - 3 veces para quitar el exceso de sangre. Almacenar la vena por congelación a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparación de configuraciones de descelularización y recelularización biorreactor
Nota: Con unas tijeras, cortadas los tubos de silicio como se muestra en la tabla 1.
<ol><li>
Configuración de descelularización 1 (para perfusión Triton X-100 y lavado)
	<ol>
<li>A un 2 L compartimiento (recipiente de plástico), cinta todas las tres piezas de tubo como se muestra en la figura 1A. Nota: La cinta un tubo a una pared donde el borde toque la parte inferior de la cámara (entrada de detergente) y los otros dos tubos a la pared opuesta con una distancia de 5-10 cm en función de la longitud de la vena. Por lo menos 5 cm de estos tubos debe también ser adherida con cinta al piso de la cámara (entrada y salida de la vena).</li>
		<li>Utilizando los conectores Luer macho y hembra, se conectan en serie entrada del detergente al tubo B seguido por el tubo F, tubo C y finalmente a la entrada de la vena. Lugar el tubo F en el cassette de la peristáltica de la bomba me.</li>
		<li>Tomar otro tubo y conecte un extremo al enchufe de la vena. Coloque el otro extremo en el tarro de cristal con salida de la manguera inferior que se coloca a 45 cm por encima de la cámara (toma de detergente) y cinta adhesiva para asegurar. Tomar el tubo G y empuje un extremo de la salida de la manguera de la jarra de vidrio y coloque el otro extremo en la cámara de la vena. Nota: Las imágenes de instalación completa (flechas rojas), cámara y dirección (flechas blancas) se muestran en la figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descelularización configuración 2 (TnBP para perfusión)
	<ol>
<li>Tomar un frasco de vidrio de 1 L y coloque un extremo del tubo C (entrada de detergente) en la jarra hasta que el tubo toque el fondo de la jarra.</li>
		<li>Conecte el otro extremo al tubo F seguido de tubo C. Coloque el otro extremo del tubo C en la jarra hasta la mitad de profundidad (entrada de la vena). Coloque el tubo de F en el cartucho de la bomba peristáltica.</li>
		<li>Tomar el tubo D y coloque un extremo en la jarra (salida de la vena) hasta la mitad de la profundidad y el otro extremo en el tarro de cristal con el tubo inferior colocado a una altura de 45 cm de la entrada de la vena (toma de detergente). Para asegurar, cintas tubos de entrada y salida de detergente.</li>
		<li>Coloque la jarra de vidrio de 1 L en un agitador magnético y mantener el imán dentro de la botella.</li>
		<li>Tomar el tubo G y empuje un extremo en la salida de la manguera de la jarra y coloque el otro extremo un tarro de cristal 1 L. Nota: La imagen de instalación completa (flechas rojas), cámara y flujo de dirección (flechas blancas) se muestra en la figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descelularización configuración 3 (perfusión de DNasa)
	<ol>
<li>Tome una botella de vidrio de 250 mL y colocar ambos extremos del tubo C. lugar la zona media del tubo en el cartucho de la bomba peristáltica II. Nota: Un extremo del tubo es la entrada de la solución y el otro extremo del tubo está conectado a la entrada de la vena. Salida de la vena queda libre en la solución.</li>
		<li>Coloque la configuración entera incluyendo la bomba a 37 ° C. La imagen de instalación completa y la dirección del flujo se muestra en la figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biorreactor de recelularización
	<ol>
<li>Mantenga todas las piezas como se muestra en la figura 2A.</li>
		<li>Como se muestra en la figura 2B, tomar el tapón de 4 Inserte en cada puerto, H (salida de la vena) del tubo, tubo I (entrada de los medios de comunicación) y tubo J (entrada de la vena). Inserte el otro extremo del tubo de H en el puerto 4 deth (medio de comunicación). Nota: La vista de la tapa de 4 puertos de la parte superior se muestra en la figura 2. Para una fácil inserción de tubos, corte los bordes a un punto agudo con una tijera.</li>
		<li>Doble el otro extremo del tubo de J en forma de U y atar con una sutura. Conecte los conectores reductores a los extremos interiores de los tubos H & J.</li>
		<li>Coloque el tubo de 60 mL con una base plana en la botella de vidrio de 250 mL y luego colocar la anterior configuración hecha en el tubo como se muestra en la Figura 2D. Como se muestra en la Figura 2E, conecte los tubos K, E y K en la serie. Conecte un tubo K a la entrada de la vena y otro tubo K a la entrada de los medios de comunicación. Nota: El diagrama esquemático de la configuración y la dirección del flujo se observa en la figura 2F.</li>
		<li>Esterilice en autoclave los el biorreactor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de soluciones
<ol><li>Solución 1 (10 x agua): para 1 L de agua ultrapura, añadir 2 g de azida de sodio y 18,6 g de ácido etilendiaminotetracético (EDTA). Revolver hasta que sales se disuelven.</li>
	<li>Solución 2 (agua de x 1): 100 mL de solución 1 y añadir 900 mL de agua ultrapura.</li>
	<li>Solución 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL de agua ultrapura, añadir 50 mL de Triton X-100, 1 g de azida de sodio y 9,3 g de EDTA. Revuelva hasta que se disuelva.</li>
	<li>Solución 4 (1 x Triton X-100): 200 mL de solución 3 y añadir 800 mL de agua ultrapura.</li>
	<li>Solución 5 (1 x TnBP): Añadir 10 mL de TnBP con una pipeta de 10 mL a 990 mL de solución 2.</li>
	<li>Solución 6 (40 Kunitz unidades/mL DNasa): Añadir Kunitz de 2.000 unidades de DNaseI en 50 mL de fosfato Buffer salino de Dulbecco que contiene CaCl2 y MgCl2. Preparar fresco y utilizar inmediatamente.</li>
	<li>Solución 7 (PBS): Añadir 24 g de cloruro de sodio, 0.6 g de cloruro de potasio, 4,32 g de fosfato de sodio y 0,72 g de fosfato de potasio al 3 L de agua ultrapura. Revuelva hasta que se disuelva. Ajustar el pH a 7.4. 1 L de PBS en el autoclave de esterilizar y almacenar por separado.</li>
	<li>Solución 8 (0,1% de ácido peracético): Añadir a 50 mL de solución estéril 7, 50 μl de ácido peracético. Preparar fresco y utilizar inmediatamente.</li>
</ol>4. preparación del medio endotelial
<ol><li>Añadir 5 mL de L-glutamina, 5 mL de anti-anti, 50 mL de suero humano AB y todos los componentes del kit de factor de crecimiento de EGM-2 excepto suero fetal bovino a 500 mL del medio de MCDB131 bajo una campana de estéril.</li>
</ol>5. descelularización de vena safena
<ol><li>Descongelar la vena safena humana de-80 ° C a temperatura ambiente. Otra vez congelar a-80 ° C y descongelar otra vez a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una biopsia de 2 mm de longitud con unas tijeras de cortar y fijar en formol durante 24-48 h a temperatura ambiente. Atar cada extremo de la vena a las barbas de un conector Luer macho y hembra con una sutura.</li>
	<li>Conectar la vena a la configuración de la descelularización 1 y llenar 1 L de solución 2. Perfusión de 15 min a 35 mL/min vaciar el contenido de la configuración.</li>
	<li>Añadir 1 L de solución 4 y perfusión de 4 h a 35 mL/min vaciar el contenido de la configuración.</li>
	<li>Añadir 500 mL de solución 2 y perfusión de 5 minutos vaciar el contenido de la configuración. Repita este paso. Desconecte la vena de configuración de perfusión 1 y conectar a instalación de perfusión 2.</li>
	<li>Añadir 1 L de solución 5, encienda el agitador y perfusión durante 4 h a 35 mL/min. Nota: Solución 5 parece nublado después de convertirse en el agitador y la perfusión.</li>
	<li>Desconecte la vena de configuración perfusión 2 y lavar la vena fuera y por dentro con jeringa o una pipeta de 10 mL en 4 cambios de agua ultrapura para 5-10 minutos.</li>
	<li>Conectar la vena a configuración de perfusión 3, añadir 50 mL de solución 6 y perfusión de 10 mL/min en una cámara de 37 ° C por 4 h. vaciar el contenido de la instalación y desconecte la vena de la configuración.</li>
	<li>Conectar la vena para configuración de perfusión 1, llenar 1 L de solución 2 y perfusión durante la noche a 35 mL/min, repita el paso 5.4 paso 5.9 4 veces (para un total de 5 ciclos). Tomar una biopsia otra vez como se ha dicho en el paso 5.2. Nota: Omitir paso 5.8 segunda parte en los ciclos 1 y 3.</li>
	<li>Vacíe el contenido de la configuración. Llenar 1 L de solución 2 y perfusión durante 24 h a 35 mL/min solución el cambio 2 después de 12 h. vaciar el contenido de la configuración. Llenar 1L de agua ultrapura y perfusión durante 24 h a 35 mL/min cambio agua ultrapura después de 12 h.Empty el contenido de la configuración. Llenar 1 L de solución 7 y perfusión durante 24 h a 35 mL/min solución el cambio 7 después 12 h.</li>
</ol>6. verificación de descelularización
<ol><li>El formol fijada biopsias en agua ultrapura para proceso a 15 minutos en un procesador de tejidos siguiendo protocolos de lavado e incrustar en parafina22.</li>
	<li>Cortar 5 secciones μm utilizando un micrótomo y mancha con hematoxilina y 0.2% alcohólica eosina Meyer (H & E) siguiendo protocolos estándar22.</li>
	<li>Ver bajo un microscopio para verificar la pérdida de los núcleos en el tejido decellularized en comparación al tejido normal.</li>
</ol>7. recelularización
<ol><li>Esterilizar la vena colocando en un tubo de 50 mL que contenga 50 mL de solución 8. Agitar a 80 revoluciones por minuto (rpm) en la coctelera por 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Manejar una vena bajo la cabina de flujo laminar (LAF) de ahora en adelante para mantener la esterilidad. La transferencia de la vena utilizando pinzas estériles a un nuevo tubo de 50 mL que contenga 50 mL de solución estéril 7 y 500 μl de anti-anti. Menee como arriba de 12 h. cambio solución 7 al menos dos veces en el medio.</li>
	<li>Utilizando pinzas estériles, transferir la vena a un nuevo tubo de 50 mL y agregar 50 mL de medio de endotelial. Menee como arriba de 11 h.</li>
	<li>Montar el biorreactor utilizando guantes estériles en el gabinete de LAF. Atar la vena a vena entrada y salida con sutura estéril y pinzas el biorreactor.</li>
	<li>Conectar la vena con el biorreactor y el relleno con el mismo medio. Añadir heparina 50 IU/ml y perfusión de 1 h a 2 mL/min a 37 ° C.</li>
	<li>Recoge 15-25 mL de sangre fresca (dependiendo de la longitud de la vena) de la donante en tubos de vacutainer heparina cubierto y diluir 1:1 con solución Steen. Después, agregar derivados de glándula endocrina factor crecimiento endotelial vascular (EG-VEGF, 80 ng/mL), factor de crecimiento básico del fibroblasto (b-FGF, 4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL).</li>
	<li>El biorreactor se mueven a una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 y perfusión durante 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Aproximadamente después de 12 h, mover el biorreactor a un gabinete, LAF tomar una gota de sangre y medir la glucosa usando un dispositivo de monitoreo de glucosa en sangre. Si el nivel es menos de 3 mmol/L, añadir glucosa a traer en el rango de 7 a 9 mmol/L. repetir este paso cada 8-12 h.</li>
	<li>Después de 48 h, el biorreactor en el gabinete de LAF y drenar la sangre del biorreactor. Añadir 30 mL de solución estéril 7 y perfusión por 5 min la solución de drenaje. Añadir 30 mL de solución estéril 7 y perfusión durante 5 minutos repetir dos veces o hasta que el color rojo de la sangre se pierde. Nota: La biopsia se puede tomar para la verificación del accesorio de la célula. Desconectar la vena, cortar los bordes de 5 mm de la vena con tijera y deshacerse de ellos. Tomar una biopsia como se indica en el paso 5.2 y conectar la vena de nuevo al reactor biológico (paso opcional).</li>
	<li>Agregue 30-45 mL de medio de endotelial y perfusión durante 96 horas en la incubadora a 2 mL/min. Nota: Agregue medio endotelial hasta que la vena esté sumergida.</li>
	<li>Mover el biorreactor en el gabinete LAF, desconectar la vena recellularized, cortar los bordes de 5 mm de la vena utilizando tijeras y deseche. Tomar una biopsia como se indica en el paso 5.2.</li>
</ol>8. verificación de recelularización
<ol><li>Siga las instrucciones en la sección 6 y realizar la tinción H & E. Examinar los portaobjetos en un microscopio para detectar la presencia de células.</li>
</ol>

<ol>
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SSH tiene acciones en Verigraft, una empresa que ha licenciado la tecnología de la ingeniería de los vasos sanguíneos de tejidos. Otros autores no tienen nada que revelar.

La técnica presentada aquí de descelularización de venas safenas es un método fácil, sencillo y rentable que puede aplicarse también a todas las venas de pequeño diámetro como las venas umbilicales y mamarias. Las soluciones de descelularización y sus concentraciones utilizadas en este método son de nuestros anteriores resultados6,7. Aunque se recomiendan 5 ciclos de descelularización, en ciertas venas también notamos descelularización completa en 3 ciclos. Sin embargo, se obtuvieron resultados reproducibles mediante el uso de 5 ciclos. Aplicación de este protocolo, decellularized las venas de distintas longitudes hasta 30 cm con éxito (inédito resultado). Salida de la solución de la descelularización de elevación de 45 cm creará una presión de 33 mmHg dentro de la vena. En nuestra experiencia, nos dimos cuenta de esto como un paso clave en decellularizing la vena todo uniforme y reproducible en 5 ciclos. La presión solicitada es 3 veces mayor que la presión de la vena safena normal (5-10 mmHg) pero es que el mismo como incompetente de las venas (varices)23. Además, especulamos que esta alta presión crea una fuerza significativa en las paredes de la vena y puede, por lo tanto, ayudar en la remoción de células más rápido y eficiente.
Ya TnBP es un solvente orgánico insoluble en agua, revolviendo el detergente hasta que se convierte en turbia es importante; de lo contrario, flotará el detergente. Por la misma razón, para mantener TnBP mezclado en solución, se colocó el tubo de salida de detergente en la parte superior de la jarra de cristal con salida de la manguera. Eliminación eficiente de TnBP de la vena después de su uso en cada ciclo se aprecia por la ausencia de flotante TnBP gotitas en el agua lavado. También hemos notado que también omitiendo el paso de la ADNasa produce un tejido decellularized pero en algunos casos, se observó un relativamente alto contenido de ADN en el tejido decellularized. Como de alta presión y alto caudal no es necesarios para la eficiente actividad de DNasa, puede utilizarse una tasa de perfusión baja (10 mL/min). Se utilizó una bomba peristáltica diferentes debido a su tamaño más pequeño ayuda en el fácil manejo de la configuración. Puesto que nos dimos cuenta de que el daño de la mayoría de las células durante resultados de descelularización en ciclo 2, sugerimos saltar tratamiento de DNasa durante los ciclos 1 y 3 (resultados no publicados). A pesar de la caracterización y cuantificación de proteínas de matriz extracelular no se realizaron en este manuscrito, nuestra experiencia anterior con protocolos similares de descelularización demostró la preservación de propiedades biomecánicas, estructura y proteínas de matriz extracelular7. Aunque nuestros experimentos de cuantificación preliminar con estas venas produjeron un resultado similar (inédito), nuestros resultados ya publicados van a fortalecer esta confianza.
Recelularización con sangre es un proceso fácil y práctico sobre las células de la médula ósea ampliada como uno puede evitar largos tiempos de expansión celular, mutaciones espontáneas en células ampliadas, invasión quirúrgica y molestias para el paciente. Ya se sabe que endotelialización también puede ocurrir por circulación de EPCs, presumimos la perfusión de sangre seguido de perfusión con endotelial medio será suficiente para recelularización. La seguridad de los tejidos vena diseñado usando un método similar es vista desde resultados exitosos de trasplante cuando dos tales venas fueron implantadas en niños con obstrucción de vena porta extra hepática7. Especulamos que los factores de crecimiento en decellularized matriz extracelular permite el accesorio de EPCs de circulación de sangre24. Recelularización de venas siguiendo un protocolo similar demostró las células positivas para el receptor VEGF-2 y cluster de diferenciación (CD) 14 en el lumen y CD45 se observaron células expresa en adventicia7. También nos imaginamos que una continua capa endotelial puede no observarse en todos los casos sobre todo cuando con sangre de pacientes mayores y enfermas como es sabido que tales individuos han disminuido el número de circulación de las células progenitoras25. Sin embargo, postulamos que la perfusión con el destinatario sangre muchos de los antígenos que están expuestos debido a descelularización y así pueden disminuir las posibilidades de reacciones inflamatorias adversas cuando trasplantados en comparación con sólo el trasplante puede enmascarar decellularized de los vasos sanguíneos. Además, la perfusión de la sangre puede depositar aumento en los niveles de factores de crecimiento en la luz y la adventicia, que a su vez puede reclutar mayor número de células progenitoras, lo que resulta en un rápido proceso de recelularización en vivoen circulación.
Las ventajas del diseño del biorreactor utilizado en este estudio son completa esterilización en autoclave, fácil montaje, rentabilidad, fácil manejo y la menor posibilidad de daños. En nuestra experiencia, utilizando el diseño actual, las venas se recellularized hasta 10 cm de longitud. A pesar de las venas hasta 25 cm de largo también puede ser recellularized manteniendo la vena en forma de "U" en el biorreactor, esto debe ser validado. El diseño del biorreactor muestra que la dirección del flujo en la vena es contra la gravedad y está diseñada como tal porque es la dirección normal del flujo de estas venas en los seres humanos. La perfusión de 12 h del paso medio endotelial es requisito la vena y aumenta la afinidad para la fijación de las EPCs. Además de la heparina adicional y perfusión de 1 h disminuirá el riesgo de formar coágulos de sangre en los tubos durante la perfusión de la sangre.
El volumen de sangre requerido depende de la longitud de la vena. El principio básico que seguimos para el volumen de sangre es que la vena debe estar sumergida en la sangre. Durante la manipulación de volúmenes de sangre mayores de 45 mL, mezclando ocasionalmente podría ser necesario para evitar la acumulación de células en la parte inferior del biorreactor. Hemos añadido solución de Steen sangre ya que contiene una alta cantidad de proteínas y componentes necesarios para mantener los tejidos sanos durante el trasplante de órgano26,27. Adición de VEGF y FGF b es beneficioso ya que son factores de crecimiento de angiogenic potente28 y su presencia induce la migración, proliferación y diferenciación de EPCs29,30,31,32 . La cantidad de VEGF añadido se basa en nuestros anteriores resultados inéditos donde fue vista la proliferación de las EPCs a 80 ng/mL. Además de la aspirina inhibe la activación de las plaquetas33 disminuyendo las posibilidades de su adhesión a la capa endotelial. Monitoreo continuo y la adición de glucosa también será beneficiosos para prevenir la hemólisis de glóbulos rojos y proliferación celular.
Ya que sólo una muestra de sangre simple se requiere del receptor, puede considerarse como un procedimiento fácil y factible que requieren menos técnicos. A pesar de todo el procedimiento que se muestra aquí de principio a fin tarda 20 días, guardar las venas decellularized como un producto acortará el procedimiento para 8 días para los pacientes fuera de la plataforma. Aunque almacenamiento de venas decellularized técnicamente no debería afectar la eficiencia de recelularización, deben ser evaluado. Ingeniería de tejidos las venas generadas siguiendo este procedimiento pueden utilizarse en la clínica para cirugías de bypass, reemplazando las venas obstruidas, insuficiencia venosa a las venas varicosas sin necesidad de inmunosupresión y proporcionando así una mejor calidad de vida para el paciente.

Conductos vasculares son necesarios para varias condiciones clínicas como aneurismas, estenosis de la arteria carótida y ateroesclerosis llevando a problemas vasculares severos. Cirujanos utilizan conductos vasculares autólogos, alogénicos o sintéticos para restaurar el suministro de sangre funcional. Aunque el uso de vasos sanguíneos autólogos todavía se considera el enfoque ideal, la disponibilidad en pacientes está mayormente limitada. Las alternativas tales como injertos alogénicos o sintéticos tienen profundos problemas con tratamientos inmunosupresores y pobre permeabilidad hacia la reintervención1,2, resultando en salud importante cargas económicas a los países. Ingeniería del tejido fino de los vasos sanguíneos pretende ofrecer injertos con una homología natural y células autólogas. Así, el recipiente sistema inmune reconoce el injerto trasplantado como uno mismo y desde tal injerto contiene las células en la configuración original y proteínas naturales, podría funcionar mejor en comparación con las alternativas actuales. Tejido había diseñado órganos, tales como la vejiga3la uretra4, la tráquea5y las venas6,7, se han utilizado con éxito en la clínica.
Ingeniería de tejidos para producir injertos personalizados requiere un injerto de un donante, seguido de descelularización y recelularización. Descelularización es una prometedora tecnología para eliminar las células de los tejidos y órganos8,9,10. Descelularización puede realizarse por métodos físicos, químicos y enzimáticos específicos11 o combinándolas. En el uso óptimo de estos métodos, los tejidos decellularized pueden tener proteínas estructurales y funcionales similares en una matriz extracelular similar al tejido nativo. Tales órganos poseen la capacidad intrínseca para mejorar el apego, la migración, proliferación y diferenciación de las células madre.
Recelularización es un proceso dinámico de la siembra de células en el injerto y receptor de las células madre pueden utilizarse para trasplante de la clínico. Células madre actualmente utilizadas para tales propósitos incluyen la médula ósea, mesenquimal y órgano residentes3,5,6. Animales y estudios orientados a la investigación han utilizado células madre de origen mesenquimal que son pluripotentes inducidas y fetal12,13,14. Este proceso requiere un biorreactor (una cámara que contiene la vena y proporciona las condiciones necesarias como temperatura, gases, pH y presión), las células y los medios de cultivo. El reto de recelularización es obtener el número de células de un tipo particular y una estrategia de siembra por el cual las células pueden llegar a todo tejido u órgano. A pesar de que ningún órgano o tejido completo estructural y funcionalmente ha generado y evaluado hasta ahora, varios avances en el campo y los resultados iniciales demuestran la posibilidad futura de15. La función clave de la vena se encuentra en el endotelio luminal que controla la infiltración de células inflamatorias en los tejidos y la capa media de músculo liso que ayuda en la constricción y también proporciona la fuerza necesaria para mantener la presión arterial16. Los estudios han demostrado que durante el daño, endotelialización ocurre de anastomosis o de circulación de las células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre17,18,19. Nuestra estrategia de recelularización de venas se basa en las EPCs presentes en la sangre circulante.
Ingeniería de tejidos de venas y arterias se realizó por varios grupos siguiendo diferentes descelularización y recelularización estrategias20,21. Nuestro grupo también ha actuado y desarrollado estrategias descelularización y recelularización para venas ilíacas y mamaria6,7. Descelularización fue realizada por la agitación de la vena en Tritón X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) y la enzima desoxirribonucleasa (DNasa). La recelularización fue realizada usando médula ósea derivado de células endoteliales y musculares lisas6 o7de la sangre periférica. Las venas recellularized por cualquier protocolo demostrada promesa clínica en la prestación de suministro de sangre funcional en el trasplante de pacientes pediátricos con extra hepática de la vena porta obstrucción6,7.
Actualmente hemos desarrollado una versión modificada del mismo protocolo para la actuación mejorada y fácil de descelularización y recelularización biorreactor manejo de venas de pequeño diámetro. El protocolo actual de descelularización requiere perfusión de detergentes a través de la vena utilizando presión en lugar de agitación con detergentes. El protocolo de recelularización implica un paso adicional de preacondicionamiento para mejorar la adhesión celular y la adición de factores de crecimiento en la circulación de la sangre para mejorar la supervivencia, proliferación y adhesión celular. También hemos mejorado el diseño del biorreactor utilizando productos comercialmente disponibles. En este trabajo presentamos una descripción detallada del protocolo modificado para realizar descelularización y recelularización de venas safenas humanas.

<table><tbody><tr><td>4-Port Cap</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl salicylic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS with CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Growth Factors Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass bottle 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Coated Vacutainer Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Female with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Female with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 5/32&quot; ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>For 5X8mm silicon tube</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Per acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td></tr><tr><td>Peristaltic pump II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen solution</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butyl Phosphate</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>Tube 60ml with flat base</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tube A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr></tbody></table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Conductos vasculares utilizados en la mayoría de las cirugías vascular son injertos alogénicos o sintéticos que a menudo conducen a las complicaciones causadas por la inmunodepresión y pobre permeabilidad. Ingeniería de tejidos ofrece una solución novedosa para generar injertos personalizados con una matriz extracelular natural que contiene células del destinatario utilizando el método de descelularización y recelularización. Mostramos un método detallado para realizar la descelularización de la vena safena humana y recelularización por la perfusión de la sangre periférica. La vena fue decellularized por perfusión 1% Tritón X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) y 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonucleasa (DNasa). Triton X-100 y TnBP fueron perfundidos a 35 mL/min durante 4 h y DNasa se perfunde en 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. La vena fue lavada en agua ultrapura y PBS y luego esterilizada en 0,1% de ácido peracético. Se lavó otra vez en PBS y precondicionada en medio endotelial. La vena fue conectada a un biorreactor y perfundida con medio endotelial que contiene 50 IU/mL heparina por 1 h. recelularización fue realizada por llenar el biorreactor con sangre fresca, diluido 1:1 en solución Steen y agregando derivados de glándula endocrina vascular factores de crecimiento endotelial (80 ng/mL), factores de crecimiento básico del fibroblasto (4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL). El biorreactor fue trasladado a una incubadora y perfundido durante 48 h a 2 mL/min, manteniendo la glucosa entre 3-9 mmol/L. Más tarde, la vena se lavaron con PBS, lleno de medio endotelial y perfundida durante 96 horas en la incubadora. Tratamiento con Tritón X-100, TnBP y DNasa decellularized la vena safena en 5 ciclos. La vena decellularized parecía blanca a diferencia de las venas normales y recellularized (rojo claro). La hematoxilina y eosina (H & E) coloración demostró la presencia de núcleos sólo en normal pero no en las venas decellularized. En la vena recellularized, H & E tinción demostraron la presencia de células en la superficie luminal de la vena.

La morfología gruesa de una vena normal es luz roja (Figura 3A). El color rojo se pierde en la descelularización progresiva ciclos (ciclo 2, figura 3B; ciclo 3, figura 3) y por el 5to ciclo, se ve pálido y blanco (figura 3D). La vena recellularized después de la perfusión de la sangre (figura 3E) y perfusión de medios endotelial (figura 3F) se ve rojo brillante en color. Los 5 ciclos de tratamiento de descelularización habían quitado con éxito las células de la vena como no se ven núcleos azul en la tinción H & E (Figura 4B). En contraste, varios núcleos fueron vistos en la vena normal (Figura 4A). La presencia de células conectadas en el lado luminal se observa tinción H & E en el recellularized de la vena con sangre durante 48 h (figura 4, flechas negras) y después de la perfusión con el medio endotelial de 96 h (figura 3D, flechas negras).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montaje de instalaciones de perfusión de descelularización. A) la imagen que muestra la configuración de descelularización montado 1 para Triton X-100 y lavado. Las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican las entradas y salidas para vena y soluciones. B) el cuadro que muestra la configuración de descelularización montado 2 para perfusión TnBP. Del mismo modo, como en configuración de descelularización 1, las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican las entradas y salidas para vena y soluciones. C) el cuadro que muestra la configuración de descelularización montado 3 para perfusión de desoxirribonucleasa. Las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican entradas de vena y soluciones. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparación y montaje del biorreactor de recelularización. A) cuadro muestra materiales necesarios para montar el biorreactor. B) imagen del interior de la tapa del puerto de 4 que muestra la colocación de conectores (flechas rojas), de reducir los puntos para conectar la vena de entrada y salida (flechas blancas) y arreglo de tubos de H, I y J. El extremo libre del tubo de H se coloca en el biorreactor para devolver los medios de comunicación. C) se observan los tubos respectivos entrando y saliendo de la parte superior del tapón de 4. D) foto mostrando el biorreactor montado. E) cuadro que muestra la configuración entera del biorreactor con la bomba peristáltica. Los tubos K amplían las conexiones desde el biorreactor a la bomba peristáltica. F) la representación esquemática del sistema de perfusión de biorreactor todo. Las flechas naranjas indican la dirección del flujo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Bruto morfología de las venas durante la descelularización y recelularización. A) la morfología gruesa vena normal se ve rojo brillante en color. El color se pierde con el aumento del número de ciclos de descelularización B) ciclo 2 y C) ciclo 3. D) por 5 ciclos, la vena se ve pálido y blanco. La vena después de perfundiendo con E) sangre durante 48 h y F) con el medio endotelial de 96 h se ve rojo brillante una vez más en color. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterización de las venas decellularized y recellularized. La hematoxilina y eosina tinción imagen de A) vena normal contiene muchos núcleos azul pero están ausentes en B) la vena decellularized. En la vena recellularized con C) sangre durante 48 h y con D) observó medio endotelial por 96 h, fijación de las células (flechas negras) en el lumen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Aquí, describimos un protocolo para la vena safena descelularización mediante detergentes y recelularización, perfusión de la sangre periférica y la endotelial.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K vistas.  University of Gothenburg. Aquí, describimos un protocolo para la vena safena descelularización mediante detergentes y recelularización, perfusión de la sangre periférica y la endotelial.

Video: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Investigación

Bioingeniería

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autólogo de células progenitoras endoteliales-Siembra Tecnología y las pruebas de biocompatibilidad para dispositivos cardiovasculares en el modelo animal de gran

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimiento para safena humana Venas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión y refuerzo externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Medicina

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative wound complications. This standardized protocol for antegrade endoscopic vein harvesting (EVH) from the lower leg has the potential to be introduced to routine coronary artery bypass grafting (CABG). Patients undergoing CABG surgery are positioned on a surgical table with two additional foam rollers below the extended legs, enabling antegrade EVH from the lower leg. Following minimally invasive surgical access through a bridging vein harvest technique, an endoscopic optical dissector is inserted antegrade into the wound. The main vessel and side branches are dissected under continuous optical control of vein quality status and the working channel. After, an endoscopic optical retractor is inserted with an internal bipolar electrocoagulation device for precise, safe, and tissue-protective interruption of side branches. After release of the vein, the vessel is cut off at the proximal and distal ends under optical control, retrieved from the wound, then cannulated and flushed with heparinized saline. Finally, all side branches of the vein graft are double-clipped. Vascular histology is analyzed in a randomized selection of vein samples. After applying this standardized EVH protocol, the learning curve was shown to be steep, and graft quality was sufficient for coronary artery bypass grafting in every case. There was no conversion to surgical harvesting and low risks for tissue damage and bleeding. Leg positioning and synergizing EVH with bridging vein harvesting improved procedural success and vein graft quality. In our hands, antegrade EVH from the lower leg was feasible, demonstrating straightforward graft dissection as well as adequate macroscopic and microscopic graft quality with preserved endothelial integrity. In conclusion, the introduced technique is safe, shows excellent vein autograft quality, and illustrates feasibility for elective and urgent isolated CABG and combined CABG scenarios.

Presented here is a protocol for antegrade endoscopic vein harvesting from the lower leg, which can safely be introduced in routine coronary artery bypass grafting. Vein grafts present excellent graft quality following this standardized protocol with positioning of the legs, minimally invasive access to the vein, and antegrade endoscopic vein harvesting.

Endoscópica antegrada sinérgica con cosecha de venas puente para mejorar la calidad del injerto de vena safenosa desde la pierna inferior

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

Un sistema de entrenamiento y pruebas para la realización de reconstrucción vascular en Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

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