המרכז קרן נובו נורדיסק מחקר מטבולית בסיסית היא מרכז מחקר עצמאי ב אוניברסיטת קופנהגן חלקית במימון של תרומה בלתי מוגבלת של הקרן נובו נורדיסק.

1. טיפול אנזים הגבלה
<ol><li>Linearize mtDNA על ידי טיפול הכולל דנ א אנושי עם האנזים הגבלה BamHI, שחותך במיקום 14258 ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי. הערה: עכבר ה-DNA, לשימוש של אנזים הגבלה BglII בתנאים זהים להלן.</li>
	<li>לכל אחד לטעום איפה mtDNA מתילציה כדי להיות מוערך, להכין שפופרת אחת של התגובה 0.2 מ"ל ולהוסיף את הבאים מערבבים: 3 μg הדנ א (לכמת על-ידי fluorometry), 15 μL מאגר 3, 3 μL BamHI ומים עד 150 μL</li>
	<li>מניחים צינורות הצנטרפוגה תרמי במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. ביסולפאט ההמרה
<ol><li>להמיר דנ א BamHI שטופלו באמצעות ביסולפיט כמתואר29.</li>
	<li>השתמש 200-500 ng שטופלו BamHI DNA עבור כל תגובה ההמרה הנפח הכולל של 20 μL. ההתאוששות הדנ א הוא 50-70%.</li>
	<li>Elute ה-DNA המרה ביסולפאט במאגר • תנאי μL 10.</li>
	<li>לכמת חד גדילי הדנ א על-ידי fluorometry.</li>
	<li>אופציונלי: חנות המרה ביסולפאט DNA ב-20 ° C לפני שתמשיך את הנותרים של הפרוטוקול. לאחסון לטווח ארוך, לאחסן המרה ביסולפאט DNA ב-80 מעלות צלזיוס</li>
</ol>3. עיצוב של ביסולפאט רצף תחל
<ol><li>עיצוב צבעי יסוד רצף ביסולפאט באמצעות כלים מקוונים Methprimer30 BiSearch31,32. הערה: Methprimer BiSearch מאפשרות לחפש רצפים מחייב פריימר על רצף גנומית איפה cytosines מומרים thymines, בדומה לטיפול פוסט-ביסולפאט.</li>
	<li>עבור הגברה מיטבי, לא משוחד, להימנע CpG dinucleotides ב תחל ולעצב את גודל אמפליקון בין 100-300 bp.</li>
	<li>ודא תחל בעיצוב ספציפי ל- DNA מיטוכונדריאלי באמצעות הפונקציה של BiSearch חיפוש פריימר. להוסיף את תחל כבר מעוצב ביסולפאט המרה, סמן את התיבה ביסולפאט וכוללים גנום הפניה ופרמטרים PCR. הערה: רשימת מוצרים PCR אפשרי יוצג.</li>
	<li>להעתיק העליון רצפים פריימר 1-5, הדבק אותם בטופס ההזמנה של סינתזה oligonucleotide. הערה: רשימה של האדם רצפי פריימר mtDNA העכבר אשר אומתה במעבדה מוצגת בטבלה1.</li>
	<li>הבדיקה תחל תוך שימוש ביסולפאט המרה PCR בעקבות agarose בג'ל כפי שמתואר בשלב 4. מבחן למטב כל זוגות פריימר בנפרד, להבטיח שגודל אמפליקון הנכון מופיע על הג'ל agarose. הערה: אם תחל ריבוב נדרשים, להוסיף primers רבים לאחד יחיד PCR התגובה והמחש את המוצרים PCR agarose בג'ל או, שיטה יותר resolutive כגון לזיהוי בג'ל, כדי להבחין בין מוצרים דומים גודל.</li>
</ol>4. ביסולפאט המרה PCR והפקת ג'ל
<ol><li>כדי להגביר את האזורים של הריבית, לבצע PCR באמצעות אנזימים להתחיל חם. בקצרה, לערבב 100 ng המרה DNA 500 תחל חוש וחוש אנטי-מיקרומטר, 1 µL dNTP מיקס (10 מיקרומטר של כל dNTP), פולימראז ב- U-תגובה 7.5 בהנפח הכולל של µL 50. להפעיל את ה-PCR עם התנאים הבאים: 5 דקות ב 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס. השתמש תחל גם בנפרד או מרובב.</li>
	<li>אופציונלי: כאשר ריבוב תחל, שימוש 200 ng המרה DNA ו אופניים התנאים הבאים: 5 דקות 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס. הערה: טמפרטורה עשוי להשתנות בהתאם טמפרטורת ההיתוך של צבעי יסוד.</li>
	<li>נושא ה-PCR מוצרי ג'ל אלקטרופורזה על 2% agarose ב100 וולט.</li>
	<li>תחת אור UV עדין, לחלץ את מוצרי ה-PCR עם איזמל ולהוסיף microtubes. אל תחשוף PCR מוצרים לאור UV מופרז כדי למנוע נזק לדנ א. להימנע זמן החשיפה מעל גיל 30 s.</li>
	<li>לטהר את המוצרים PCR באמצעות ג'ל לטיהור כפי שתואר לעיל3.</li>
	<li>לכמת את ה-DNA מטוהרים מהשלב 4.5 באמצעות fluorometry. המשך שלב 5 או מאגר דגימות ב-20 ° C.</li>
</ol>5. רצף ספריית הכנה ביסולפאט
<ol><li>לבצע הכנה ספריה של המרה ביסולפאט מוצרי ה-PCR. אופציונלי: מגה-פלקס PCR מוצרים בשלב זה.</li>
	<li>לבצע סוף-תיקון באמצעות עד 100 ננוגרם של מוצר ה-PCR. מוסיפים 3 µL סיום ההכנה אנזים 6.5 µL סוף תיקון התגובה מאגר (10 x) למוצר ה-PCR µL 55.5 בשפופרת 0.2 מ"ל. למקם, דגירה צינור הצנטרפוגה תרמי למשך 30 דקות ב- 20 ° C ואחריו 30 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים מתאמים רצף על ידי ערבוב ה-DNA לתקן-סוף עם 15 µL בלאנט/ת א ליגאז מיקס, 2.5 µL מתאם, משפר מצדו µL 1. אם משתמש < 100 מוצר ה-PCR ng כקלט, לדלל מתאם 10 פעמים.</li>
	<li>מניחים את התערובת (שלב 5.3) הצנטרפוגה תרמי, דגירה 15 דקות ב 20 º C. להשהות הצנטרפוגה תרמי ולהוסיף 3 µl משתמש אנזים ברכבת התחתית. לערבב, למקם את הצינור בחזרה הצנטרפוגה תרמי, דגירה 15 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>גודל לבחור את ה-DNA ובין אם-לא מתאם באמצעות חרוזים מוצק שלב הפיך הנייח (אלוהים אדירים) עם יחס בדרגות שונות של חרוזים ל- DNA בהתאם לגודל המוצר ה-PCR.</li>
	<li>הוסף 13.5 µL H2O ל- DNA ובין אם-לא מתאם שלב 55 ו 5.4 µL resuspended אלוהים אדירים חרוזים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומקום צינור על דוכן מגנטי. כאשר הפתרון ברור, להעביר את תגובת שיקוע צינור ולמחוק את שפופרת המכילה את החרוזים. הערה: תגובת שיקוע מכיל את ה-DNA ובין אם-לא מתאם, חלקים לא רצויים גדול מאוגדים החרוזים שהושלכו.</li>
	<li>להוסיף 25 µL resuspended אלוהים אדירים חרוזים תגובת שיקוע מהשלב 5.6, לערבב, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי ולמחוק את תגובת שיקוע כאשר הפתרון ברור. הערה: תגובת שיקוע שהושלכו מכיל DNA לא רצויים, ואילו ה-DNA ובין אם-לא מתאם מאוגד חרוזים.</li>
	<li>בעוד הצינורית על הדוכן מגנטי, הוסף 200 µL 80% אתנול (הטרי) לשטוף את החרוזים. דגירה 30 s, הסרה, להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף.</li>
	<li>חרוזים אוויר יבש במשך 5 דקות תוך הצינור הוא מעמד מגנטי עם מכסה פתוח.</li>
	<li>הסר את הצינורית של המגנט, elute ה-DNA במאגר • תנאי 23 µL ומערבבים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.</li>
	<li>מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי, כאשר הפתרון ברור, להעביר 2 µL צלחת PCR 96-ובכן עבור הגברה טרום-PCR (שלב 5.14).</li>
	<li>להעביר את µL 21 כ השאר צינור 0.2 מ"ל עבור הגברה PCR (שלב 5.17). הערה: הקפד לא להעביר כל חרוזים כמו חרוזים יכול לעכב תגובות אנזימטיות של הצעדים הבאים.</li>
	<li>המשך שלב 5.14 או מאגר דגימות ב-20 ° C.</li>
	<li>בצע קדם-PCR ההגברה ידי RT-qPCR כדי להעריך את מספר מחזורי הדרושים כדי להגביר את ה-DNA ובין אם-לא מתאם. לכל תגובה, להוסיף הפעולות הבאות ב- PCR 96-ובכן צלחת 2 µL המכילה DNA (שלב 5.11): פריימר אינדקס µL 0.4 0.4 µL אוניברסלי PCR פריימר, 7.2 µL H2O, מיקס מאסטר RT-qPCR 10 µL.</li>
	<li>מקם את הצלחת במכונת ה-PCR בזמן אמת ונושא את הצלחת לתנאים הבאים: 30 s ב 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 מחזורים; 5 דקות 65 ° C.</li>
	<li>להעריך את מספר מחזורי הגברה הדרושים עבור כל דגימה על-ידי חיסור Ct-ערך אחד ערך ה-Ct קדם הגברה RT-qPCR התואם לסוף השלב הליניארי של תגובת ה-PCR.</li>
	<li>להגביר את ה-DNA ובין אם-לא מתאם מ שלב 5.12 על ידי ערבוב: 21 µL DNA, 25 µL PCR מיקס מאסטר, פריימר אינדקס µL 1, פריימר PCR אוניברסלי µL 1 ו 2 µL H2O. ב הצנטרפוגה תרמי, נושא כל מדגם לתנאים הבאים: 30 s ב 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [מחושב Ct משלב 5.16] מחזורי; 5 דקות 65 ° C. הערה: זכור להשתמש רק אחד פריימר אינדקס עבור דגימה כדי לאפשר ריבוב. המדד נוסף במהלך PCR.</li>
	<li>לטהר את החרוזים DNA אלוהים אדירים מוגבר, elute במאגר • תנאי µL 22.</li>
	<li>לשלוט באיכות הספרייה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה או חלופה בשיטה. חפשו גדלים שיא הספריה המתאימה (PCR מוצרים בגודל בתוספת מתאם).</li>
	<li>לאמוד את גודל בסיס-זוג ממוצע של המוצרים ספריה על ידי השמצות ניתוח: הגדרות כלליות מתקדם, לחץ פעמיים על "השולחן" תחת השמצות ניתוח. הגדרת האזור מ- 100-1000 bp ' ולחץ על ' אישור'. תחת אזור שולחן, האזור שהוגדר מופיע, ספריית גודל ממוצע (bp) מחושבת.</li>
	<li>לכמת ספריות על-ידי fluorometry. המשך שלב 6 או חנות ספריות ב-20 ° C.</li>
</ol>6. רצף הדור הבא
<ol><li>לחשב את הריכוז nM של ספריות באמצעות הנוסחה: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>לדלל ספריות nM ריכוז למשל 2 ננומטר אותו (לבחור 4 nM, 2 ננומטר, 1 ננומטר, או 0.5 ננומטר בהתאם ספריית ריכוזים). מאגר כל ספריות להשגת מאגר של 2 ספריות ננומטר.</li>
	<li>Denature ו לדלל ספריות בעקבות המדריך כלי עריכה ברצף. בקיצור: Denature הבריכה 2 ננומטר על-ידי הוספת 0.2 N NaOH, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק Dilute הבריכה denatured לדילול הסופי 10 בלילה. Denature ו לדלל ספריה שליטה זמינים מסחרית לדילול הסופי ו־12-5 בערב. אל צינור חדש, מערבבים הבריכה 10 בלילה עם 20% ו־12-5 pM בקרת ספרייה. הערה: המרה ביסולפאט מציג את מורכבות נמוכה מאוד. 20% בקרת ספרייה ספייק בתגרום רצף באיכות טובה יותר.</li>
	<li>להפעיל לחץ דם 150 לזווג-קצה רצף שימוש בכלי רצף עמוק.</li>
</ol>7. חישובית ניתוח - אומדן מתילציה רמות
<ol><li>ליצור קבצי .fastq (המכונה כאן sample1_R1.fastq.gz ו- sample1_R2.fastq.gz), ליצור אינדקס ביסמרק של הגנום כולו עניין (כאן בתיקיה בשם bismarkIndex) ולוודא כי רצף גנומית של chrM זמין ב- fasta תבנית (כאן בתיקיה בשם chrM).</li>
	<li>לעבד מראש קריאות כדי להסיר מתאמים ודעות קדומות שהציג את צבעי יסוד: השתמש בכלי Trim_galore33. הסר את שני נוקלאוטידים 5' סוף שתי קריאות ואחורה. trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o.... / trim1 - לזווג sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>ליישר קריאות מעובד מראש כדי הגנום כולו באמצעות ביסמרק34 ביסמרק, dovetail - באם -o-/-/ bismarkIndex /-1./sample1_R2_val_2.fq.gz./sample1_R1_val_1.fq.gz-2 הערה: אם aligner אחר, ודא כי מושמטות קריאות זה לא יכול להיות מיושרים באופן ייחודי.</li>
	<li>תמצית קורא מיפוי כרומוזום ה M, כאן על ידי שימוש Samtools35 samtools למיין - O -l 0 BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools מדד sample1_sorted.bam samtools להציג -u sample1_sorted.bam chrM | samtools למיין - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>לחלץ את המידע מתילציה bismark_methylation_extractor -p - CX-- מקיף - cytosine_report genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>השתמש את .bedGraph, את עמודי או הקבצים CX_report.txt לניתוח נוסף. השתמש בקובץ sample1_chrM.CX_report.txt ויזואליזציה ולבדיקה.</li>
	<li>לבצע חיתוך נוסף בשלב preprocessing, אם אזורים מרובים הם נחקר, דעה קדומה פריימר עשויים להיות גלויים ב- M-הטיה החלקות שנוצרו במהלך המיפוי. עיין בתיעוד של ביסמרק לקבלת מידע נוסף.</li>
</ol>8. חישוב ניתוח - מבחן של הבדלים
<ol><li>ודא כי קובץ ה-CX_report.txt מכיל 7 עמודות, כרומוזום (כאן chrM), עמדה, סטרנד, מספר הקריאות מפוגל, מספר קריאות unmethylated, הקשר C רצף שמסביב, עבור כל C על כרומוזום מ'.</li>
	<li>כפי CX_report מכסה chrM בשלמותו, בדוק את תת-הקבוצה כדי region(s) אשר מוגבר.</li>
	<li>השתמש במבחני ללא פרמטרי להבדלים בין מדגמים, כגון מבחן המדויק של דייגים של בודדות או מבחן השלט של האזור כולו. הערה: כימות לעיתים קרובות תהיו קרובים מתילציה 0%, וזו הסיבה מדוע בהנחה נורמליות אינה הולמת.</li>
	<li>באופן דומה, להמחשת, לדמיין quantiles או לחשב מרווחי הביטחון בינומי פרופורציה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria.">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li><li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome.">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).</li><li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation.">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166 (2017).</li><li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells.">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals.">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li><li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells.">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li><li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse,+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation.">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li><li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+1,+cytosine+methylation,+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria.">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li><li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern.">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li><li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter.">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).</li><li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets.">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li><li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down's+syndrome.">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li><li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics.">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li><li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria.">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li><li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism.">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li><li>Byun, H. -. M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation.">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).</li><li>Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment:+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study.">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li><li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans.">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).</li><li>Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability.">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li><li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion.">Mitochondrion.</a> MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li><li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation,+not+CpG+methylation,+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression.">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).</li><li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים להכריז.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול ביסולפאט-רצף אשר היא תוכננה במיוחד כדי לחקור mtDNA מתילציה. ההבדלים עם ביסולפאט-רצפי פרוטוקולים המשמשים עבור הדנ א טמון הניצול של צעד עיכול אנזים הגבלה מוקדמת, ניתוח bioinformatic פסק דין החוצה שווא חיוביים. הנובעות NUMT רצפים.
אנו מספקים פרוטוקול כדי להימנע ב?...

גנום מיטוכונדריאלי הוא מבנה כפול גדילי מעגלית של-16.5-קילו base (kb), המהוות של כבד, ופיסה אור. גנום מיטוכונדריאלי נוכח מספר עותקים בתוך כל תא, maternally-בירושה, ו מקודד מרכיבים חיוניים של קומפלקסי שרשרת הנשימה1. בדומה הגנום חיידקי, בניגוד הגנום הגרעיני, גנום מיטוכונדריאלי מאורגן במבנים רבים משניות ושלישוניות, כגון מבנים מפותל supercoiled2, אשר יכול לגמול גישה קשה במהלך רצף ניסויים3.
בגרעין, מתילציה של הדנ א היא סימן epigenetic בהרחבה למדה משחק תפקיד בתהליכים רבים, ובמיוחד בוויסות של ביטוי גנים. מתילציה DNA הגנום יונקים, מתרחשת בעיקר על 5-מיקום הטבעת פירימידין של deoxycytidines, בעיקר על CG dinucleotides (או CpG). מתילציה ציטוזין נמצא ב-70% של CpG כל הגנום של תאים סומטיים וחשבונות ~ 1% של סך שה-DNA בסיסים4. ה-DNA methylations בכללותה תוארה גם בהקשרים שאינם-CpG, כגון רו ח, CpT עלות לקליק, קיים בכמויות שונות ב- DNA גרעיני, עם ערכים עד 25% של כל cytosines מפוגל בתאי גזע עובריים5,6,7.
בעוד ציטוזין מתילציה של הגנום הגרעיני מקובל, קיום מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA) הוא עדיין שנוי במחלוקת. המחקר הראשון מתילציה חוקר mtDNA בוצעה בתאים בתרבית איפה mtDNA מתילציה זוהה בקלות, למרות ברמות נמוכות בהשוואה ל- DNA גרעיני8. בתאים אנושיים וטכנולוגיים מאתר, mtDNA מתילציה זוהה גם ברמות נמוכות (2-5%). באמצעות מבחני להסתמך על לכידת 5 methylcytosine כגון מפוגל immunoprecipitation דנ א (MeDIP) ואחריו PCR כמותי, mtDNA מתילציה זוהה גם מגוון העכבר של האדם ואת תאי שורות9,10, 11,12. באמצעות נוגדנים נגד 5-methylcytosine assay אליסה או ספקטרומטר מסה, רמות משמעותי של מתילציה DNA אובחנו שברים מיטוכונדריאלי מטוהרים13,14,15, 16. עם זאת, רוב מבחני במחקרים הנ ל משמש טכניקות לא תוכננו כדי לספק כימות מוחלטת של מתילציה DNA ברזולוציה-הבסיס יחיד.
ניתוח מתילציה של הדנ א resolutive וסטטיסטי יכולה להיות מושגת על ידי טכניקה בשם "ביסולפאט רצף", אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל חד גדילי הדנ א בהקשר17 . באמצעות רצף ביסולפאט, מערך של מחקרים זיהה את הנוכחות של ציטוזין מתילציה ברמות שונות. מתילציה mtDNA באזור D לופ, את 12S או האזור מטוסי אף-16 זוהה ברצון האנושי18,19,20,21,22,23 ו העכבר24 רקמות ותאים, לעומת זאת, עם השתנות מסקרן, 1-20% של סך cytosines על פני לימודי.
לעומת אלה מחקרים רבים, יש רק מעט מחקרים, כולל הקבוצה שלנו, השנויות במחלוקת על הימצאות mtDNA מתילציה3,25,26,27 או חקרו את הרלוונטיות הביולוגי של רמות נמוכות מאוד של רמות (להלן 2%) mtDNA28. לאחרונה, דווח כאן את ההתבוננות חפץ ביסולפאט-רצף פוטנציאליים ביסולפאט מיטוכונדריאלי כל רצף3. סיפקנו ראיות מבנה שניוני של דנ א מיטוכונדריאלי יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות ב רצף ביסולפאט, ובכך מפריז מתילציה רמות. אנו מספקים כאן פרוטוקול כדי למנוע חפץ של ביסולפאט-המרה של mtDNA. פרוטוקול זה משתמש של עיכול אנזימטי פשוטה של ה-DNA כדי לשבש mtDNA משני מבנים ולאפשר גישה מלאה ביסולפאט בעקבות ביסולפאט רצף פרוטוקול. בנוסף, אנו מספקים של צינור bioinformatic הנלווים לניתוח של רצף ביסולפאט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

כימות של מתילציה DNA יכולה להיות מושגת באמצעות רצף ביסולפאט, אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל, בהקשר דנ א חד גדילי. רצף ביסולפאט יכול להיות ממוקד (באמצעות PCR) או לבצע על הגנום כולו ומספק כימות מוחלטת של ציטוזין מתילציה ברזולוציה-הבסיס יחיד. בהתחשב באופי ברורים של DNA גרעיני - ו מיטוכונדריאלי, ובייחוד במבנה משני, adaptions של ביסולפאט שיטות רצף על חקירת ציטוזין מתילציה ב mtDNA צריכה להיעשות. מבנה משניות ושלישוניות mtDNA יכול בהחלט להוביל ביסולפאט רצף חפצים שמוביל שווא-תוצאות חיוביות בשל גישה המסכן דנטורציה לא שלם של ביסולפאט ל- DNA חד-גדילי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות עיכול אנזימטי של ה-DNA BamHI יחד עם bioinformatic ניתוח צינור כדי לאפשר כימות מדויק של ציטוזין מתילציה רמות ב mtDNA. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לעיצוב תחל רצף ביסולפאט ספיציפית mtDNA, כדי להימנע מיקוד מקטעי הגרעיני מיטוכונדריאלי לא רצויים (NUMTs) מוכנס לתוך הגנום הגרעיני.

שני צעדים של פרוטוקול זה מכריעים כאשר חוקרים mtDNA מתילציה. 1) פתיחת המבנה משני ועיצוב 2) של צבעי בסיס ספציפי דנ א מיטוכונדריאלי.
על ידי ה-DNA הגנומי האנושי עם האנזים הגבלת BamHI (איור 1), יהיה לחתוך את מבנה ה-DNA מיטוכונדריאלי במיקום ?...

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation at JoVE.com

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Views.  University of Copenhagen. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.

Video: Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...