Die Novo Nordisk Stiftungszentrum für metabolische Grundlagenforschung ist ein unabhängiges Forschungsinstitut an der Universität Kopenhagen, teilweise durch eine freie Spende von Novo Nordisk Stiftung finanziert.

1. Einschränkung Enzymbehandlung
<ol><li>Linearisieren Sie MtDNA durch die Behandlung der gesamten menschlichen DNS mit dem Restriktionsenzym BamHI, das an Position 14258 in der menschlichen mitochondrialen DNA schneidet. Hinweis: Für Maus-DNA, verwenden Sie das Restriktionsenzym BglII unter identischen Bedingungen wie folgt.</li>
	<li>Für jede Probe wo MtDNA Methylierung soll beurteilt werden, bereiten ein 0,2 mL Reaktionsgefäß und fügen Sie die folgende Mischung: 3 μg genomischer DNA (gemessen durch Fluorometry), 15 μl Puffer 3, 3 μL BamHI und Wasser bis zu 150 μL</li>
	<li>Platz Rohre in einem Thermocycler für 4 h bei 37 ° C.</li>
</ol>(2) Bisulfit-Konvertierung
<ol><li>BamHI-behandelte DNA mit Natrium Bisulfit an anderer Stelle beschriebenen29zu konvertieren.</li>
	<li>Verwenden Sie 200-500 ng BamHI-behandelte DNA für jede Konvertierung Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die DNA-Erholung ist 50-70 %.</li>
	<li>Eluieren Sie Bisulfit umgewandelt DNA in 10 μL Elution Puffer.</li>
	<li>Die einsträngige DNA durch Fluorometry zu quantifizieren.</li>
	<li>Optional: Speichern Sie bevor Sie fortfahren, die restlichen des Protokolls Bisulfit umgewandelt DNA bei-20 ° C. Für die langfristige Lagerung speichern Sie konvertiert Bisulfit DNA bei-80 ° C</li>
</ol>3. Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer
<ol><li>Primer für Bisulfit-Sequenzierung mit dem online-Tools Methprimer30 und BiSearch31,32zu entwerfen. Hinweis: Methprimer und BiSearch lassen sich Grundierung Bindung Sequenzen auf Genomsequenzen suchen wo Cytosines in Thymines, ähnlich wie bei Post-Bisulfit Behandlung umgewandelt.</li>
	<li>Für optimale und unvoreingenommene Verstärkung vermeiden CpG dinucleotid in die Primer und design der Amplifikate Größe zwischen 100-300 bp.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass gestaltete Primer für die mitochondriale DNA, die mit BiSearchs Funktion Primer Suchespezifisch sind. Legen Sie die bereits gestalteten Bisulfit konvertiert Primer, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bisulfit und gehören ein Referenz-Genom und PCR-Parameter. Hinweis: Es wird eine Liste der möglichen PCR-Produkte angezeigt.</li>
	<li>Kopieren Sie oben 1-5 Grundierung Sequenzen zu und fügen Sie sie in ein Bestellformular für Oligonukleotid-Synthese. Hinweis: Eine Liste von Mensch und Maus MtDNA-Primer-Sequenzen, die im Labor validiert wurde ist in Tabelle 1dargestellt.</li>
	<li>Test-Primer mit Bisulfit konvertiert PCR nach Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 4 beschrieben. Testen Sie und optimieren Sie alle Primer Paare getrennt und sicherzustellen Sie, dass die richtige Amplikons Größe auf dem Agarosegel angezeigt wird. Hinweis: Wenn multiplexing Primer benötigt werden, fügen Sie hinzu, mehrere Primer zu einem einzelnen PCR-Reaktion und visualisieren die PCR-Produkte auf Agarose-Gelelektrophorese oder eine mehr auflösenden Methode wie Polyacrylamid Gelelektrophorese, um ähnliche Produkte zu unterscheiden Größe.</li>
</ol>4. Bisulfit umgewandelt, PCR und Gel Extraction
<ol><li>Um die Regionen von Interesse zu verstärken, führen Sie durch PCR mit einem Heißstart Taq Polymerase. Kurz, Mix 100 ng umgewandelt DNA, 500 µM und Anti-Sinn Primer 1 µL dNTP-Mix (10 µM jedes dNTP) und Polymerase über 7,5 U/Reaktion in einem Gesamtvolumen von 50 µL. laufen PCR mit den folgenden Bedingungen: 5 min bei 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Primer verwenden, entweder separat oder Multiplex.</li>
	<li>Optional: Wenn Primer multiplexing, Einsatz 200 ng konvertiert, DNA und die folgenden Bedingungen, Radfahren: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Hinweis: Die Temperatur variieren je nach der Schmelztemperatur der Primer.</li>
	<li>Thema PCR-Produkte, gel-Elektrophorese auf 2 % Agarose bei 100 Volt.</li>
	<li>Unter sanften UV-Licht PCR-Produkte mit einem Skalpell zu extrahieren und mikroröhrchen hinzufügen. Setzen Sie nicht PCR-Produkte, übermäßige UV-Licht, DNA-Schäden zu vermeiden. Vermeiden Sie Belichtungszeit über 30 s.</li>
	<li>Reinigen Sie die PCR-Produkte mit Gel Reinigung wie oben beschrieben3.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die gereinigte DNA aus Schritt 4.5 mit Fluorometry. Fahren Sie mit Schritt 5 oder Shop-Proben bei-20 ° C.</li>
</ol>5. Bisulfit Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung
<ol><li>Durchführen Sie Bibliothek-Vorbereitung von Bisulfit-konvertiert PCR-Produkte. Optional: multiplex-PCR-Produkte in diesem Stadium.</li>
	<li>Führen Sie Ende-Reparatur mit bis zu 100 ng PCR-Produktes. 55.5 µL PCR-Produkt in einer 0,2 mL Tube 3 µL Ende Prep Enzym und 6,5 µL Ende Reparatur Reaktion Puffer (10 X) hinzufügen. Platzieren und Rohr in einem Thermocycler für 30 min bei 20 ° C, gefolgt von 30 min bei 65 ° c inkubieren</li>
	<li>Sequenzierung Adapter verbinden, durch das Mischen der Ende repariert DNS mit 15 µL Blunt/TA-Ligase Mix, 2,5 µL Adapter und 1 µL Ligation Enhancer. Wenn mit < 100 ng PCR-Produkt als Eingabe, verdünnen Adapter 10-mal.</li>
	<li>Legen Sie die Mischung (Schritt 5.3) in einem Thermocycler und inkubieren Sie 15 min bei 20 ° C. Anhalten der Thermocycler und 3 µl Benutzer hinzufügen Enzym am Rohr. Mischen Sie und legen Sie das Rohr zurück in den Thermocycler und inkubieren 15 min bei 37 ° c</li>
	<li>Größe wählen Sie die Adapter ligiert DNA mittels Solid Phase Reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Perlen an DNA PCR Produkt abhängig.</li>
	<li>13.5 µL H2O Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.4 und 55 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und Platz auf einem Magnetstativ. Wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen Schlauch und verwerfen Sie Röhrchen mit den Perlen zu. Hinweis: Der Überstand enthält die Adapter ligiert DNA und große unerwünschte Fragmente sind verpflichtet, die ausrangierten Perlen.</li>
	<li>Der Überstand von Schritt 5.6 25 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen, mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und verwerfen Sie den überstand zu, wenn die Lösung klar ist. Hinweis: Der ausrangierte überstand enthält unerwünschte DNA, während die Adapter ligiert DNA an Perlen gebunden ist.</li>
	<li>Während das Rohr auf die Magnetstativ ist, fügen Sie 200 µL 80 % Ethanol (frisch zubereitet) um die Perlen zu waschen. Inkubieren Sie 30 s und entfernen und entsorgen der Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.</li>
	<li>Luft trockenere Perlen für 5 min, während das Rohr auf Magnetstativ mit offenen Deckel.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnet, eluieren Sie DNA in 23 µL Elution Buffer und mischen. In 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie 2 µL auf einer 96-Well-PCR-Platte für die Pre-PCR-Amplifikation (Schritt 5.14).</li>
	<li>Der Rest ungefähr 21 µL auf eine neue 0,2 mL Tube für PCR-Amplifikation (Schritt 5.17) übertragen. Hinweis: Achten Sie nicht darauf, Perlen zu übertragen, wie Perlen enzymatische Reaktionen über die nächsten Schritte hemmen können.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 5.14 oder Shop-Proben bei-20 ° C.</li>
	<li>Führen Sie Pre-PCR Verstärkung durch RT-qPCR Schätzung die Anzahl der Zyklen erforderlich, um die Adapter ligiert DNA zu verstärken. Pro Reaktion, fügen Sie Folgendes in der 96-Well-PCR Platte mit 2 µL DNA (Schritt 5.11): 0.4 µL Index Grundierung, 0.4 µL universal PCR Primer, 7,2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR-master-Mix.</li>
	<li>Die Platte in einer Echtzeit-PCR-Maschine und die Platte mit den folgenden Bedingungen zu unterwerfen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 Zyklen; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der Verstärkung Zyklen benötigt für jede Probe durch Subtraktion eines Ct-Wert der Ct-Wert von der Vorverstärkung RT-qPCR entsprechend an das Ende der linearen Phase der PCR-Reaktion.</li>
	<li>Verstärken Sie die Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.12 durch Mischen: 21 µL DNA, 25 µL PCR-master-Mix, 1 µL Index Grundierung, 1 µL Universal PCR Primer und 2 µL H2O. In einem Thermocycler unterziehen jede Probe mit den nachfolgenden Bedingungen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [berechnete Ct aus Schritt 5.16] Zyklen; 5 min 65 ° C. Hinweis: Denken Sie daran, nur eine Index-Grundierung pro Probe zu Multiplexen. Der Index ist während der PCR eingesetzt.</li>
	<li>Reinigen Sie die amplifizierten DNA SPRI-Perlen und eluieren in 22 µL Elution Puffer.</li>
	<li>Bibliothek-Qualitätskontrolle durch Gel-Elektrophorese oder Alternative Methode. Achten Sie auf richtige Bibliothek Peak Größen (PCR-Produkt (e) Größe plus Adapter).</li>
	<li>Schätzen Sie die durchschnittliche Basenpaar Größe der Bibliothek-Produkte durch Abstrich Analyse: im erweiterten globalen Einstellungen, doppelklicken Sie auf "Tabelle" unter Abstrich Analyse. Definieren der Region von 100-1000 bp und klicken Sie auf "OK". Unter Region-Tabelledie definierte Region erscheint und Bibliothek Durchschnittsgröße (bp) wird berechnet.</li>
	<li>Bibliotheken von Fluorometry zu quantifizieren. Fahren Sie mit Schritt 6 oder Shop-Bibliotheken bei-20 ° C.</li>
</ol>(6) next Generation Sequencing
<ol><li>Berechnen Sie die nM-Konzentration der Bibliotheken mit der Formel: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Verdünnen Sie Bibliotheken, die die gleichen nM Konzentration z.B. 2 nM (Wählen Sie 4 nM, 2 nM, 1 nM oder 0,5 nM je nach Bibliothek Konzentrationen). Bündeln Sie alle Bibliotheken um einen Pool von 2 nM Bibliotheken zu erreichen.</li>
	<li>Denaturieren und Bibliotheken nach der Sequenzierung Instrument Guide zu verdünnen. Kurz gesagt: 2 nM Pool durch Zugabe von 0,2 N NaOH denaturieren und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. verdünnt denaturierte Pool zu einer Endverdünnung von 22:00. Denaturieren Sie und verdünnen Sie eine handelsübliche Steuerelementbibliothek zu einer endgültigen Verdünnung der 12:05. Mischen Sie zu einem neuen Schlauch 22:00 Pool mit 20 % 12:05-Steuerelementbibliothek. Hinweis: Bisulfit Konvertierung führt sehr geringen Komplexität. Bessere Qualität der Sequenzierung führen Bibliothek Spike-in 20 % Kontrolle.</li>
	<li>Führen Sie ein 150 bp gepaart-End Sequenzierung mit einem tiefen Sequenzierung Instrument.</li>
</ol>(7) computergestützte Analyse - Schätzung Methylierung Ebenen
<ol><li>.Fastq Dateien (hier als sample1_R1.fastq.gz und sample1_R2.fastq.gz) zu erzeugen, erzeugen einen Bismark-Index des gesamten Genoms von Interesse (hier in einem Ordner namens BismarkIndex) und stellen Sie sicher, dass die genomische Sequenz ChrM in Fasta verfügbar ist Format (hier in einem Ordner namens ChrM).</li>
	<li>Vorverarbeitung von liest entfernen Sie Adapter und Bias eingeführt durch die Primer: Verwenden Sie das Tool Trim_galore33. Entfernen Sie zwei Nukleotide aus 5'-Ende der vorwärts und rückwärts liest. Trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. /--trim1--gepaart sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Richten Sie vorbearbeitet liest, das gesamte Genom mit Bismark34 Bismark - Schwalbenschwanz - Bam -o. /. / BismarkIndex /-1-2./sample1_R1_val_1.fq.gz./sample1_R2_val_2.fq.gz Hinweis: Wenn eine andere Aligner verwendet wird, stellen Sie sicher, dass Lesevorgänge, die eindeutig ausgerichtet werden können nicht verworfen werden.</li>
	<li>Extrakt liest Mapping auf dem Chromosom M, hier mit Samtools35 Samtools sortieren -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM Samtools Index sample1_sorted.bam Samtools anzeigen -u sample1_sorted.bam ChrM | Samtools sortieren - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Die Methylierung Informationen extrahieren Bismark_methylation_extractor -p--CX--Cytosine_report--umfassende--Genome_folder. / ChrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Verwenden Sie die .bedGraph, die .cov oder die CX_report.txt-Dateien für die weitere Analyse. Verwenden Sie die sample1_chrM.CX_report.txt-Datei für die Visualisierung und testen.</li>
	<li>Führen Sie weiter Ausschnitt in der Vorverarbeitung Schritt aus, wenn mehrere Regionen verhört und eine Grundierung Vorspannung möglicherweise sichtbar in den M-Bias Parzellen erzeugt beim Mapping. Finden Sie in der Bismark-Dokumentation für weitere Informationen.</li>
</ol>(8) computergestützte Analyse - Test Unterschiede
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die CX_report.txt-Datei für jedes C auf Chromosom M 7 Spalten, Chromosom (hier ChrM), Position, Ausrichtung, Anzahl der methylierten liest, unmethylated liest, C Kontext und umliegenden Sequenz enthält.</li>
	<li>Da die CX_report ChrM in seiner Gesamtheit erfasst, überprüfen Sie die Teilmenge, die Region(en), verstärkt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie nicht-parametrischen Tests für Unterschiede zwischen den Proben, wie ein Fishers exakter Test für einzelne C oder ein Zeichen-Test für eine ganze Region. Hinweis: Quantifizierung werden oft in der Nähe von 0 % Methylierung, das ist der Grund, warum die Annahme von Normalität nicht angebracht ist.</li>
	<li>In ähnlicher Weise für die Visualisierung, Quantile zu visualisieren oder binomische Anteil Konfidenzintervall berechnen.</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt zu erklären.

Hier bieten wir ein Bisulfit-Sequenzierung-Protokoll, das speziell für die MtDNA-Methylierung zu befragen. Die Unterschiede mit Bisulfit-Sequenzierung Protokolle für genomische DNA liegt bei der Verwertung von eine vorherige Beschränkung Enzym Verdauung Schritt und eine bioinformatische Analyse Urteil, falsche positive aus NUMT Sequenzen.
Wir bieten ein Protokoll zur Bisulfit-Sequenzierung Artefakte zu vermeiden, bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. Bisulfit Sequenzierung Artefakte ...

Das mitochondriale Genom ist eine kreisförmige, doppelsträngige Struktur von rund 16,5 Kilo Base (kb) lang, bilden eine schwere und eine leichte Faser. Das mitochondriale Genom ist in mehrere Kopien in jeder Zelle, mütterlich vererbt, und wesentliche Bestandteile der Atmungskette komplexe1kodiert. Ähnlich wie bei bakteriellen Genome und anders als das Kerngenom, des mitochondrialen Genoms in zahlreichen sekundären und tertiären Strukturen, wie z. B. gewickelten und supercoiled Strukturen2, gliedert sich in die Zugang schwierig, während der Sequenzierung machen können Experimente-3.
Im Zellkern ist Methylierung der DNA ein ausgiebig studierte epigenetische Markierung, die in zahlreiche Prozesse, vor allem in der Regulation der Genexpression eine Rolle spielt. In Säugetier-Genome tritt DNA-Methylierung in erster Linie auf der 5-Position der Pyrimidine Ring der Deoxycytidines, meistens auf CG dinucleotid (oder CpG). Cytosin Methylierung findet sich bei 70 % von allen CpG im Erbgut von Körperzellen und Konten für ~ 1 % der gesamten DNA4Basen. DNA-Methylations ist auch in nicht-CpG zusammenhängen, wie CpA, CpT und CpC beschrieben worden und existieren in verschiedenen Mengen in Kern-DNA, mit Werten bis zu 25 % von allen methylierte Cytosines in embryonale Stammzellen5,6,7.
Während Cytosin Methylierung von das Kerngenom weithin anerkannt ist, ist die Existenz der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung noch umstritten. Die erste Studie untersucht MtDNA Methylierung erfolgte in kultivierten Zellen wo MtDNA Methylierung bereitwillig erkannt wurde, obwohl auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu nuklearen DNA-8. In menschlichen und murinen Zellen wurde MtDNA Methylierung auch auf einem niedrigen Niveau (2-5 %) festgestellt. Mit Berufung auf 5 Methylcytosine erfassen wie METHYLIERTE DNA Immunopräzipitation (MeDIP) gefolgt von quantitativen PCR Assays, MtDNA Methylierung wurde auch in verschiedenen Maus und Mensch erkannt und Zellen Linien9,10, 11,12. Mit Antikörpern gegen 5 Methylcytosine in einem ELISA-Test oder Massenspektrometrie, waren wesentliche Ebenen der DNA-Methylierung von gereinigten mitochondriale Fraktionen13,14,15, erkannt. 16. jedoch der Großteil der Assays in den genannten Studien verwendet Techniken, die nicht entworfen waren, um absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung bieten.
Quantitative und auflösenden DNA-Methylierung Analyse durch eine Technik namens "Bisulfit Sequenzierung", lässt sich die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einzelsträngiger DNA Kontext17 konvertieren . Eine Konstellation von Studien erkannt mit Bisulfit-Sequenzierung, die Anwesenheit von Cytosin Methylierung auf verschiedenen Ebenen. Im menschlichen18,19,20,21,22,23 und Maus24 wurde bereitwillig Methylierung MtDNA in der D-Loop-Region, der 12 s oder 16 s Region erkannt. Geweben und Zellen, jedoch mit einer faszinierenden Variabilität, von 1-20 % des gesamten Cytosines in Studien.
Im Vergleich zu diesen zahlreichen Studien haben nur wenige Studien, unter anderem von unserer Fraktion bestritten die Anwesenheit von MtDNA Methylierung3,25,26,27 oder in Frage gestellt die biologische Relevanz der sehr niedrige Niveaus von MtDNA (unter 2 %)28. Vor kurzem berichteten wir die Beobachtung eines potenziellen Bisulfit-Sequenzierung Artefakts in ganzen mitochondriale Bisulfit Sequenzierung3. Wir haben nachgewiesen, die die Sekundärstruktur der mitochondrialen DNA zu Fehlalarmen in Bisulfit-Sequenzierung, könnte damit überschätzen Methylierung Ebenen. Wir bieten hier ein Protokoll um ein Artefakt der Bisulfit-Umwandlung von MtDNA zu verhindern. Dieses Protokoll verwendet eine einfache enzymatische Verdauung von DNA zu stören MtDNA Sekundärstrukturen und vollen Zugriff auf Bisulfit nach einem Bisulfit-Sequenzierung-Protokolls zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten wir eine begleitende Bioinformatik-Pipeline für die Analyse von Bisulfit-Sequenzierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

Quantifizierung der DNA-Methylierung kann erreicht werden mit Bisulfit-Sequenzierung, die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einem einzelsträngigen DNA-Kontext zu konvertieren. Bisulfit-Sequenzierung können gezielt (mittels PCR) oder auf das gesamte Genom durchgeführt und bietet absolute Quantifizierung von Cytosin Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung. Angesichts der deutlichen der nuklearen und mitochondriale DNA, vor allem in der Sekundärstruktur, sollten Anpassungen von Bisulfit Sequenzierung Methoden für die Untersuchung von Cytosin Methylierung in MtDNA erfolgen. Sekundäre und tertiäre Struktur der MtDNA führt in der Tat zu Bisulfit Artefakte zu Fehlalarme aufgrund von unvollständigen Denaturierung schlechte Anbindung von Bisulfit einzelsträngigen DNA-Sequenzierung. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einer enzymatischen Verdauung der DNA mit BamHI gepaart mit bioinformatische Analyse Pipeline ermöglichen genaue Quantifizierung von Cytosin Methylierung Ebenen in MtDNA. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien für die Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer spezifisch für MtDNA, zur Vermeidung von unerwünschten nuklearen mitochondriale Segmente gezielt (NUMTs) in das Kerngenom eingesetzt.

Zwei Schritte in diesem Protokoll sind von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. (1) die Eröffnung der Sekundärstruktur und (2) die Gestaltung der mitochondrialen DNA-spezifischen Primer.
Durch Verdauung menschliche genomische DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Abbildung 1), die mitochondriale DNA-Struktur wird an Nukleotid Position 14.258 geschnitten werden und d...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Aufrufe.  University of Copenhagen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.

Serie: Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Zusammenfassung

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Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik