A Novo Nordisk Fundação Centro de pesquisa metabólica básica é um centro de pesquisa independente da Universidade de Copenhagen, parcialmente financiados por uma doação irrestrita da Novo Nordisk Foundation.

1. tratamento enzima de restrição
<ol><li>Linearizar mtDNA tratando o DNA humano total com a enzima de restrição BamHI, que corta na posição 14258 no DNA mitocondrial humano. Nota: Para mouse DNA, use a enzima de restrição BglII sob condições idênticas como abaixo.</li>
	<li>Para cada amostra onde a metilação do DNA mitocondrial é para ser avaliado, preparar um tubo de reacção de 0,2 mL e adicionar o seguinte mistura: 3 μg DNA genômico (quantificado pelo fluorometry), 15 μL tampão 3, 3 μL BamHI e água acima de 150 μL</li>
	<li>Coloque os tubos em um termociclador por 4 h a 37 ° C.</li>
</ol>2. bissulfito conversão
<ol><li>Converta o DNA BamHI-Tratado usando bissulfito de sódio, conforme descrito em outro lugar,29.</li>
	<li>Use 200-500 ng DNA BamHI-Tratado para cada reação de conversão em um volume total de 20 μL. A recuperação do DNA é 50-70%.</li>
	<li>Eluir o DNA de bissulfito-convertido em tampão de eluição 10 μL.</li>
	<li>Quantificar o ADN single-stranded por fluorometry.</li>
	<li>Opcional: Armazenar DNA bissulfito-convertido a-20 ° C antes de prosseguir para o restante do protocolo. Para armazenamento a longo prazo, armazenar DNA bissulfito-convertido a-80 ° C</li>
</ol>3. projeto de sequenciamento de Primers de bissulfito
<ol><li>Desenho de primers para sequenciamento de bissulfito, usando as ferramentas on-line Methprimer30 e31,de BiSearch32. Nota: Methprimer e BiSearch permitem para procurar sequências de vinculação da primeira demão sobre sequências genomic onde citosinas são convertidas em timinas, similarmente ao pós-bissulfito tratamento.</li>
	<li>Para a amplificação da ideal e imparcial, evite dinucleotídeos CpG em primers e projetar o tamanho do amplicon entre bp 100-300.</li>
	<li>Que sejam projetados primers específicos para o DNA mitocondrial, usando a função do BiSearch Busca de Primer. Inserir as primeiras demão já projetado bissulfito convertido, marque a caixa de bissulfito e incluem um genoma de referência e parâmetros PCR. Nota: Será exibida uma lista de possíveis produtos PCR.</li>
	<li>Copie o top sequências de 1 a 5 da primeira demão e colá-los em um formulário de pedidos para a síntese do oligonucleotide. Nota: Uma lista de humanos e sequências de cartilha de DNA mitocondrial de rato validado no laboratório é exibido na tabela 1.</li>
	<li>Iniciadores de teste usando bissulfito convertido PCR após eletroforese em gel de agarose, conforme descrito na etapa 4. Testar e otimizar todos os pares da primeira demão separadamente e verifique o tamanho correto do amplicon aparece sobre o gel de agarose. Nota: Se multiplexação primários são necessários, adicionar múltiplos primers para uma única reação de PCR e visualizar os produtos PCR na electroforese do gel do agarose ou, um método mais resolutiva como eletroforese em gel de poliacrilamida, para distinguir produtos de semelhante tamanho.</li>
</ol>4. bissulfito convertido do PCR e extração do Gel
<ol><li>Para amplificar as regiões de interesse, realize PCR usando uma começo quente Taq polimerase. Brevemente, mistura 100 ng convertido DNA, 500 cartilhas de sentido e anti-sentido µM, 1 µ l do dNTP mix (10 µ m de cada dNTP) e polimerase em 7,5 U/reação em um volume total de 50 µ l. executar o PCR com as seguintes condições: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Também usar primers separadamente ou multiplexado.</li>
	<li>Opcional: Quando as primeiras demão de multiplexação, uso 200 ng convertido DNA e as seguintes condições de ciclismo: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Nota: A temperatura pode variar dependendo da temperatura de fusão de primers.</li>
	<li>Produtos PCR sujeitos ao gel eletroforese em agarose 2% em 100 volts.</li>
	<li>Suave luz UV, extrair produtos PCR com um bisturi e adicionar para microtubos. Não exponha os produtos de PCR de luz UV em excesso para evitar danos ao DNA. Evitar o tempo de exposição acima de 30 s.</li>
	<li>Purifica os produtos PCR usando gel de purificação conforme descrito anteriormente3.</li>
	<li>Quantificar o DNA purificado da etapa 4.5 usando fluorometry. Prossiga para o passo 5 ou amostras de armazenamento-20 ° c.</li>
</ol>5. bissulfito sequenciamento biblioteca preparação
<ol><li>Execute a preparação da biblioteca de produtos PCR bissulfito-convertido. Opcional: multiplex produtos do PCR nesta fase.</li>
	<li>Executar reparação final usando até 100 ng do produto do PCR. Adicione 3 µ l final prep enzima e amortecedor da reação reparação final 6,5 µ l (10 x) para 55,5 µ l de produto PCR em um tubo de 0,2 mL. Coloque e incubar o tubo em um termociclador por 30 min a 20 ° C, seguido de 30 minutos a 65 ° C.</li>
	<li>Ligate adaptadores de sequenciamento, misturando o DNA final-reparado com 15 mix µ l Blunt/TA ligase, 2,5 µ l adaptador e potenciador de ligadura 1 µ l. Se usar < 100 produto PCR do ng como entrada, diluir adaptador 10 vezes.</li>
	<li>Coloque a mistura (etapa 5.3) em um termociclador e incubar 15 min a 20 ° C. Pausar o termociclador e adicione 3 µ l usuário enzima ao tubo. Misture e coloque o tubo de volta no termociclador e incubar 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Tamanho selecione o adaptador-ligado DNA usando contas de fase sólida reversível imobilização (SPRI) com razões diferentes das esferas para DNA, dependendo do tamanho do produto do PCR.</li>
	<li>Adicione 13,5 µ l H2O para adaptador-ligado DNA de passo 5.4 e 55 µ l resuspended SPRI missanga. Incube a temperatura ambiente por 5 min e coloque o tubo num suporte magnético. Quando a solução é clara, transferir o sobrenadante para um tubo novo e descartar o tubo contendo os grânulos. Nota: O sobrenadante contém o DNA de adaptador-ligados e grandes fragmentos indesejados são vinculados aos talões descartados.</li>
	<li>Adicione 25 µ l resuspended SPRI grânulos para o sobrenadante da etapa 5.6, misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Colocar o tubo no stand magnético e descartar o sobrenadante, quando a solução é clara. Nota: O sobrenadante Descartado contém DNA indesejado, Considerando que o DNA de adaptador-ligado está vinculado a grânulos.</li>
	<li>Enquanto o tubo é o suporte magnético, adicione 200 µ l 80% de etanol (preparado) para lavar os grânulos. Incubar 30 s e remover e descartar o sobrenadante. Repita esta etapa para um total de 2 lavagens.</li>
	<li>Ar secos grânulos por 5 min, enquanto o tubo é em suporte magnético com uma tampa aberta.</li>
	<li>Retire o tubo do ímã, Eluir o DNA em tampão de eluição 23 µ l e misture. Incube a temperatura ambiente por 2 min.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético e quando a solução é clara, 2 µ l de transferência para um prato PCR de 96 poços para a amplificação do pre-PCR (etapa 5.14).</li>
	<li>Transferi o restante de aproximadamente 21 µ l para um novo tubo de 0,2 mL para amplificação por PCR (etapa 5.17). Nota: Certifique-se de não transferir qualquer grânulos como grânulos podem inibir reações enzimáticas dos próximos passos.</li>
	<li>Prossiga para a etapa 5.14 ou amostras de armazenamento-20 ° c.</li>
	<li>Execute a amplificação do pre-PCR por RT-qPCR para estimar o número de ciclos necessários para amplificar o DNA do adaptador-ligados. Por reação, adicionar o seguinte no PCR de 96 poços da placa contendo 2 µ l DNA (etapa 5.11): cartilha de índice 0,4 µ l, 0,4 µ l universal do PCR da primeira demão, 7,2 µ l H2O, 10 µ l RT-qPCR mestre mix.</li>
	<li>Coloque a placa em uma máquina PCR em tempo real e sujeito a placa para as seguintes condições: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 ciclos; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Estime o número de ciclos de amplificação necessária para cada amostra subtraindo um valor de Ct para o Ct-valor do pré-amplificação RT-qPCR correspondente ao fim da fase linear da reação de PCR.</li>
	<li>Amplificar o DNA adaptador-ligados da etapa 5.12 misturando: 21 µ l DNA, 25 µ l PCR master mix, 1 µ l índice da primeira demão, 1 µ l do PCR Universal da primeira demão e 2 µ l H2O. Em um termociclador, sujeito cada amostra para as seguintes condições: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [Ct calculado da etapa 5.16] ciclos; 5 min 65 ° C. Nota: Lembre-se de utilizar somente uma primeira demão de índice por amostra para permitir a multiplexação. O índice é inserido durante a PCR.</li>
	<li>Purificar os grânulos SPRI DNA amplificados e eluir em tampão de eluição 22 µ l.</li>
	<li>Controlar a qualidade da biblioteca pelo método de gel de eletroforese ou alternativa. Procure por tamanhos de pico de biblioteca correta (tamanho do produto (s) PCR mais adaptador).</li>
	<li>Estimar o tamanho médio de pares de base do produto de biblioteca pela análise do esfregaço: em avançada configurações globais, clique duas vezes em "tabela" sob análise do esfregaço. Definir a região de 100-1000 bp e clicar Okey. Sob a Mesa da região, a região definida aparece e biblioteca de tamanho médio (bp) é calculada.</li>
	<li>Quantificar as bibliotecas por fluorometry. Prossiga para o passo 6 ou bibliotecas de armazenamento-20 ° c.</li>
</ol>6. na próxima geração de sequenciamento
<ol><li>Calcule a concentração de nM de bibliotecas, usando a fórmula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Diluir as bibliotecas para o mesmo nM nM de concentração por exemplo 2 (escolher 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou 0,5 nM, dependendo da concentração de biblioteca). Todas as bibliotecas para alcançar uma piscina de 2 bibliotecas nM da piscina.</li>
	<li>Desnaturar e diluir bibliotecas seguindo o guia de instrumento de sequenciamento. Em suma: desnaturar o pool nM 2 adicionando 0,2 N NaOH e incubar a temperatura ambiente por 5 min. diluir a piscina desnaturada para uma diluição final de 22:00. Desnaturar e diluir uma biblioteca de controle comercialmente disponível para uma diluição final de 12:05. Para um novo tubo, misture o pool de 22:00 com a biblioteca de controle 12:05 20%. Nota: Conversão de bissulfito introduz complexidade muito baixa. 20% de controle de biblioteca spike resultará em melhor qualidade de sequenciamento.</li>
	<li>Execute um 150 bp emparelhado-final em sequência usando um instrumento de sequenciamento profunda.</li>
</ol>7. computacional análise - níveis de metilação de estimativa
<ol><li>Gerar arquivos de .fastq (aqui chamados de sample1_R1.fastq.gz e sample1_R2.fastq.gz), gerar um índice de bismark do genoma inteiro de interesse (aqui em uma pasta chamada bismarkIndex) e certifique-se de que a sequência genômica de chrM está disponível em fasta formato (aqui em uma pasta chamada chrM).</li>
	<li>Pré-processar leituras para remover adaptadores e viés introduzido por primers: Use a ferramenta Trim_galore33. Remova os dois nucleotídeos da extremidade 5' do lê ambos frente e verso. trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. / --trim1 - emparelhado sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Alinhar o pre-processed leituras para o genoma inteiro usando Bismark34 Bismark - andorinha..--bam -o. /. / bismarkIndex / o-1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Nota: Se outro alinhador é usado, certifique-se de que lê o que não pode ser alinhado com exclusividade é descartadas.</li>
	<li>Extrato lê o mapeamento para o cromossomo M, aqui usando Samtools35 samtools classificar -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools índice sample1_sorted.bam samtools Ver os chrM de sample1_sorted.bam -u | samtools classificar - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Extrair as informações de metilação bismark_methylation_extractor -p - CX..--cytosine_report..--abrangente..--genome_folder. /./sample1_chrM.bam chrM</li>
	<li>Use o .bedGraph, os COV ou os arquivos de CX_report.txt para uma análise mais aprofundada. Use o arquivo sample1_chrM.CX_report.txt para visualização e teste.</li>
	<li>Execute o recorte ainda mais na etapa de pré-processamento, se várias regiões são interrogadas e um viés de primeira demão pode ser visível nas tramas M-viés geradas durante o mapeamento. Consulte a documentação do Bismark para obter mais informações.</li>
</ol>8. computacional análise - teste de diferenças
<ol><li>Certifique-se de que o arquivo CX_report.txt contém 7 colunas, cromossomo (chrM aqui), posição, vertente, número de leituras metilados, número de leituras unmethylated, C contexto e sequência circundante, para todos os C no cromossomo M.</li>
	<li>Como o CX_report cobre chrM em sua totalidade, verifique o subconjunto para a região (ões) que é amplificado.</li>
	<li>Use testes não-paramétricos para as diferenças entre as amostras, tais como o teste exato de um pescadores do C individual ou um teste de sinal-para toda uma região. Nota: Quantificação será frequentemente perto de 0% de metilação, que é a razão por que supondo que a normalidade não é apropriado.</li>
	<li>Da mesma forma, para visualização, ou Visualizar quantiles ou calcular intervalos de confiança de proporção binomial.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria.">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li><li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome.">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).</li><li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation.">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166 (2017).</li><li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells.">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals.">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li><li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells.">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li><li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse,+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation.">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li><li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+1,+cytosine+methylation,+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria.">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li><li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern.">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li><li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter.">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).</li><li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets.">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li><li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down's+syndrome.">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li><li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics.">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li><li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria.">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li><li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism.">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li><li>Byun, H. -. M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation.">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).</li><li>Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment:+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study.">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li><li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans.">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).</li><li>Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability.">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li><li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion.">Mitochondrion.</a> MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li><li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation,+not+CpG+methylation,+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression.">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).</li><li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).</li><li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethPrimer:+designing+primers+for+methylation+PCRs.">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li><li>Tusn&#225;dy, G. E., Simon, I., V&#225;radi, A., Ar&#225;nyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiSearch:+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes.">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).</li><li>Ar&#225;nyi, T., V&#225;radi, A., Simon, I., Tusn&#225;dy, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BiSearch+web+server.">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes para declarar.

Aqui, nós fornecemos um protocolo de bissulfito-sequenciamento que é projetado especificamente para interrogar a metilação do DNA mitocondrial. As diferenças com bissulfito-sequenciamento protocolos usados para DNA genômico situa-se na utilização de uma enzima de restrição prévia etapa de digestão e uma análise de bioinformatic acórdão fora falsos positivos decorrentes NUMT sequências.
Nós fornecemos um protocolo para evitar artefatos de bissulfito-sequenciamento ao investigar...

O genoma mitocondrial é uma estrutura circular, double-stranded de aproximadamente 16,5 kg base (kb), constitui um pesado e um fio de luz. O genoma mitocondrial está presente em várias cópias dentro de cada célula, herdado maternalmente e codifica componentes essenciais da cadeia respiratória complexos1. Semelhantes aos genomas bacterianas e ao contrário do genoma nuclear, o genoma mitocondrial é organizado em numerosas estruturas secundárias e terciárias, como em estruturas enrolado e supercoiled2, que pode tornar o acesso difícil durante o sequenciamento experiências3.
No núcleo, metilação do DNA é uma marca epigenética extensivamente estudada que desempenha um papel em vários processos, nomeadamente na regulação da expressão gênica. Em genomas de mamíferos, a metilação do DNA ocorre principalmente na posição 5 do anel pirimidina de deoxycytidines, principalmente de dinucleotídeos CG (ou CpG). Metilação de citosina é encontrada em 70% de todos os CpG no genoma de células somáticas e contas para ~ 1% do totalque 4bases de DNA. Methylations de DNA também tem sido descrita em contextos não-CpG, como CpA, CpT e CpC e existem em várias quantidades no DNA nuclear, com valores até 25% de todas as Citosinas metiladas em células-tronco embrionárias5,6,7.
Enquanto o methylation do cytosine do genoma nuclear é amplamente aceito, a existência de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial é ainda controversa. O primeiro estudo investigar methylation DNA mitocondrial foi realizado em pilhas cultivadas onde a metilação do DNA mitocondrial foi prontamente detectada, embora em níveis mais baixos em comparação com nuclear DNA8. Em células humanas e murino, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em níveis baixos (2-5%). Utilizando ensaios contando com 5 metilcitosina captura, tais como imunoprecipitação de DNA metilada (MeDIP) seguida por PCR quantitativo, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em vários rato e humanos e células linhas9,10, 11,12. Usando anticorpos contra 5-metilcitosina em um ensaio de ELISA ou espectrometria de massa, níveis substanciais de metilação do DNA foram detectados purificada fracções mitocondrial13,14,15, 16. no entanto, a maioria dos ensaios nos estudos acima mencionados utilizado técnicas que não foram projetadas para fornecer a quantificação absoluta de metilação do DNA na única base-resolução.
Análise de metilação de DNA quantitativo e resolutiva pode ser alcançado por uma técnica chamada "bissulfito de sequenciamento", que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil em single-stranded DNA contexto17 . Usando o sequenciamento de bissulfito, uma constelação de estudos detectou a presença de metilação de citosina em vários níveis. DNA mitocondrial de metilação na região D-loop, a 12S ou região 16S prontamente foi detectado em humano18,19,20,21,22,mouse de23 e24 tecidos e células, no entanto, com uma variabilidade de intrigante, de 1-20% do totais citosinas através de estudos.
Em comparação com estes numerosos estudos, poucos estudos, incluindo do nosso grupo, têm disputado a presença de DNA mitocondrial metilação3,25,26,27 ou questionado a relevância biológica de níveis muito baixos de mtDNA níveis (abaixo de 2%)28. Recentemente, nós relatamos a observação de um artefato de bissulfito-sequenciamento potencial em toda mitocondrial bissulfito sequenciamento3. Nós fornecemos evidências de que a estrutura secundária do DNA mitocondrial pode levar a resultados falsos positivos sequenciamento de bissulfito, desse modo, superestimando os níveis de metilação. Nós fornecemos aqui um protocolo para evitar um artefato de bissulfito-conversão de DNA mitocondrial. Este protocolo utiliza uma simples digestão enzimática do DNA para interromper estruturas secundárias do DNA mitocondrial e permitir o acesso total ao bissulfito, seguindo um protocolo de sequenciamento de bissulfito. Além disso, nós fornecemos um pipeline de bioinformatic acompanhamento para a análise do sequenciamento de bissulfito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

Quantificação de metilação do DNA pode ser conseguida usando sequenciamento de bissulfito, que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil, num contexto single-stranded DNA. Sequenciamento de bissulfito pode ser direcionado (usando PCR) ou executadas no genoma inteiro e fornece quantificação absoluta de metilação de citosina na única base-resolução. Dada a natureza distinta de DNA nuclear e mitocondrial, nomeadamente a estrutura secundária, devem ser feitas adaptações de métodos de sequenciamento de bissulfito para investigar a metilação de citosina no DNA mitocondrial. Estrutura secundária e terciária de DNA mitocondrial de fato pode levar a bissulfito artefatos levando a falso-positivos devido a acesso de pobres incompleta desnaturação de bissulfito de ADN single-stranded de sequenciamento. Aqui, descrevemos um protocolo usando uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com pipeline de análise de bioinformatic para permitir a quantificação exata da citosina níveis de metilação no DNA mitocondrial. Além disso, podemos fornecer diretrizes para projetar os primers de sequenciamento de bissulfito específicos para DNA mitocondrial, para evitar a segmentação segmentos NUclear mitocondrial indesejáveis (NUMTs) inserido no genoma nuclear.

Duas etapas neste protocolo são cruciais ao investigar a metilação do DNA mitocondrial. 1) a abertura da estrutura secundária e 2) o projeto de primers de específicas de DNA mitocondriais.
Digerindo o DNA genômico humano com a enzima de restrição BamHI (Figura 1), a estrutura de DNA mitocondrial será cortada no nucleotídeo posição 14.258 e estrutura secundária será aberta.
<p class...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K visualizações.  University of Copenhagen. Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Vídeo: Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genética

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...