Name: methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי CPRIT ומחקר הדרכה פרס RP140105, כמו גם נתמך בחלקו על ידי ארה&quot;ב National Institutes of Health (NIH) מעניק R01 GM114142 ועל ידי ויליאם &amp; Ella אוונס רפואי Research Foundation.

כל הרקמות מתקבלות לאחר אישור ועדת דירקטוריון הסקירה המוסדית וכאשר כל המשתתפים הסכימו הם בניתוחים מולקולריים ומחקרים ומעקב. הפרוטוקולים מאושרים על ידי ועדת לימודי האדם באוניברסיטת למדעי הבריאות מרכז טקסס בסן אנטוניו. 1. לכידת DNA מתיל-מחייב (MBDCap) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דגימת DNA ובידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף גידול בתפזורת או דגימות רקמה נורמליות מן דגימות רקמה מוטבעת פרפין חולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת מיני DNA מסחרית לבודד הדנ&quot;א הגנומי מן דגימות הרקמה מוטבעת פרפין על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת העשרה DNA מפוגלת עם ההליך המתואר כאן על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוז ראשוני הערה: חרוזים משמשים זוג עם חלבון MBD-ביוטין, אשר מזהה מתילציה DNA על הגנום. חרוזים בדרך כלל מושעיםבתמיסת מניות. השתמש בשלבים הבאים כדי לשטוף את הנוזל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את המניה של חרוזים streptavidin (ראה לוח חומרים) על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי לקבל השעיה הומוגנית. אין לערבב את החרוזים על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית מיקרוגרם של ה- DNA קלט, add10 μL של חרוזים לצינור עם 90 μL של 1x לאגד / הצפת לשטוף. סובב דקות 1. אל תערבב ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור (ים) על מדף מגנטי עבור 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל עם טפטפת וזורקים את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף את החרוזים ולסובב דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.2.3 - 1.2.5 פעמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צימוד חלבון MBD-ביוטין חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 1.2 מיקרוגרם של ה- DNA קלט, להוסיף 7 μL (3.5 מיקרוגרם) של חלבון MBD-ביוטין על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 93 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף לחלבון לעשות נפח סופי של 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את חלבון חרוזיםתערובת על מערבל סיבוב ב RT במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקטועה DNA (קלט) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA Sonicate על ידי הוספת 1.2 מיקרוגרם של ה- DNA הגנומי הכולל 96 μL של חיץ TE ו -24 μL של 5x לאגד / לשטוף חיץ לבצע פתרון 120 μL. לשימוש כוח של 30 ו OFF כוח 30 s במהלך sonication, 20 - 25 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 1 μL של פתרון ה- DNA sonicated באמצעות מערכת bioanalyzer עם ערכת DNA מסחרי רגישות גבוהה כדי לבדוק את גודל שברי להיות בטווח של 150 - 350 נ&quot;ב על פי פרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את-חרוזי MBD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל MBD-חרוזים על מתלה מגנטי 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים את הנוזל עם טפטפת בלי לגעת חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים עם 250 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את החרוזים על מערבל סיבוב ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.5.1 - 1.5.4 פעמים. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה ללכוד DNA מקוטע (DNA קלט 1 מיקרוגרם) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התערובת דנ&quot;א / הצפת הצינור המכיל את החרוזים MBD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את-חרוזים MBD עם ה- DNA על מערבל סיבוב של 1 ש &#39;ב RT. לחלופין, לערבב O / N ב 4 מעלות צלסיוס </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת DNA הלא שנתפסו מן החרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב דנ&quot;א MBD-חרוזים, במקום צינור על המדף המגנטי דקות 1. לרכז את כל החרוזים על הקיר הפנימי של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל supernatant עם טפטפת ולשמור אותו צינור microcentrifuge DNase ללא נקי כמו DNA nonmethylated. אחסן מדגם זה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של 1x לאגד / הצפה לשטוף את החרוזים כדי לשטוף את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את החרוזים על מערבל סיבוב 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מתלה מגנטי 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל עם טפטפת ולשמור אותו צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווהture התגובות של ≤1 מיקרוגרם של ה- DNA קלט, חזור על שלבים 1.7.3 - 1.7.6 עבור 2 שברים לשטוף יותר בסך הכל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution חלק יחיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חיץ דלת מלח עם חיץ גבוה מלח (1: 1) כדי לקבל חיץ elution (1,000 מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 200 μL של חיץ elution (1,000 מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים על מערבל סיבוב 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מתלה מגנטי 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינור במקום על המדף המגנטי, להסיר את הנוזל עם טפטפת בלי לגעת חרוזים עם קצה פיפטה, ולשמור אותו צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge DNase ללא נקי. אחסן מדגם זה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.8.1 - 1.8.4 פעם, איסוף הדגימה השנייה באותו צינור (הנפח הכולל יהיה 400 μL). חנות המדגם ונקווה על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממטרי אתנול (ניקוי DNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל noncaptured, לשטוף, ו elution חלק from על השלבים הקודמים, להוסיף 1 גליקוגן μL (20 מיקרוגרם / μL, כלולים בערכה), 1/10 מדגם נפח של נתרן אצטט 3M, pH 5.2 (למשל, 40 μL לכל 400 μL של המדגם) ו -2 כרכים מדגם של 100% אתנול (למשל, 800 μL לכל 400 μL של המדגם). ההיקף הכולל הוא 1,241 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה ב -80 מעלות צלסיוס לפחות h 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 15 דקות ב 11,363 XG ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של אתנול 70% קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 11,363 XG ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.9.6 - 1.9.7 פעם וסרה supernatant שיורית הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש גלולה עבור ~ 5 דקות. אין לייבש את הגלולה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה DNA ב 37.5 μL של מים ללא DNase או אחריםהיקף המאגר מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ה- DNA על הקרח או לאחסן את ה- DNA ב -20 מעלות צלסיוס או מתחת עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי הסכום הכולל של ה- DNA הוא מעל 20 ng, (למשל, להשתמש במערכת quantitation fluorometric, ראה לוח חומרים). </li></ol></li></ol> רצף 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שברי הדנ&quot;א שנמצא הליך MBDCap על רצף. עבור כל דגימה כדי להיות רצף, בסכום כולל של 20 - 40 DNA ng נדרש הכנת ספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת ספרייה-seq DNA להשתמש במערכת בניית ספרייה אוטומטית לחלוטין (ראה לוח חומרים) ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי המסופק על ידי היצרן. קטעי דנ&quot;א בחר בגודל 200 - נ&quot;ב 400 להכנת הספרייה. המערכת כן ספריית האוטומציה מאפשרת סטנדרטיזציה של הליך הכנת הספרייה ומזעור הווריאציה על פני הדגימות בשל הכנה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשלת מתאם השתמשrs ו לדלל את ריכוז 100x. מתוך זה, השתמש 10 μL עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צעד 2.2, להוציא את התגובה, ולכמת את הספרייה seq-דנ&quot;א באמצעות מערכת quantitation fluorometric (ראה לוח חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הליך הגברת PCR. הבחירה של שילוב הורים PCR היא לשפר את יעילות ה- PCR של אזור מועשר GC של הגנום. בתוך צינור PCR, להוסיף 15 μL הספרייה DNA-seq, 25 תמהיל מאסטר μL PCR (ראה לוח חומרים), 2 תערובת פריימר μL PCR (ראה לוח חומרים), ו -8 μL H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם להמלצת PCR מיצרן של מיקס מאסטר PCR, שינוי פעמי אופניים וטמפרטורות עבור חומרי מוצא אינם אחידים: 98 o C למשך 45 שניות, מחזורי X של 98 o צלזיוס למשך 15 שניות, 65 o C למשך 30 שניות, 72 o צלזיוס למשך 30 s ולאחר מכן 72 מעלות צלסיוס 1 דקות. חזק ב 4 מעלות צלסיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerfORM מספיק מחזורים כדי בסופו של דבר עם 2 - 10 ננומטר של ה- DNA ספריה (8 - 10 מחזורים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות תגובת PCR עם 1: 1 יחס של חרוזי טיהור PCR על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם 20 - חיץ elution 30 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברקוד מדגם וברכת 4 דגימות יחד לנתיב אחד של תא זרימה. השתמש בפרוטוקול הקריא ליחיד 50 נ&quot;ב עבור סידור (ראה לוח חומרים). </li></ol> 3. ביואינפורמטיקה ניתוח הערה: תהליך נוסף קבצי fastq הגלם המתקבלים רצף לבצע בקרת איכות ומיפוי רצפי דנ&quot;א הקצר (כניסות) לגנום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Bowtie קצר לקריאה aligner, כלי מיפוי הגנום על כל קובץ מדגם fastq למפות את מקריא הגנום התייחסות. כלי מיפוי קריאה רבים זמינים לבצע שלב זה וניתן להשתמש בו על בסיס העדפה אישית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר עד 2 חוסר התאמה של וולדואר קורא תוך מיפוי הגנום ההתייחסות. דווח עד 20 המערכים טובים ביותר עבור כל אחד מהם קראו. לדוגמה, השתמש עניבת פרפר -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 &lt;ebwt&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש LONUT 9 לשחזר את להכפיל ממופה קורא לשיפור זיהוי של האזורים המועשרים. עבור כל קריאה, לכל היותר יישור אחד יהיה התאושש כאשר היא קרובה מספיק לכל הפסגות בשם לעיל. לדוגמה, השתמש: perl lonut.pl -G hg19 -w 250 -p 99 &lt;alignFile&gt; &lt;outputPath&gt;. LONUT יבצע את הפעולות הבאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי פיצול ממופים באופן ייחודי קוראים להכפיל ממופה קורא. שיא על Call ממופה באופן ייחודי קורא באמצעות מתקשר שיא חגורת 11. האפשרות -w 250 -p 99 בפקודה למשל הם עבור חגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב באופן ייחודי ממופה קורא עם התאושש קורא המתקבל LONUT, ואת בשילוב קורא, בפורמט BED, ישמש לניתוח נוסף. לחשב את מספר COMBINאד קורא לנורמליזציה בעתיד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סל קורא. חלץ קורא האזור של עניין באמצעות סקריפט perl: perl methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; -up &lt;הזרם הארכת אורך&gt; -dn &lt;במורד אורך הארכת&gt;. עבור כל קובץ מיטה המפורט sampleInfoFile, תסריט פרל מבצע את המשימות שלהלן. הערה: ראה קובץ קידוד משלים סקריפט Perl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סל קורא לתוך גודל סל קבוע, למשל, 100 נ&quot;ב, עבור 24 כרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל גן המפורט refGeneFile, לחלץ את הפחים סביב אתר תחילת שעתוק (TSS), עד אורך ההרחבה המתאים אפשרות -up ו -dn. לדוגמה, לחלץ את הנתונים באזור זה מלמעלה ועד למטה 4 kb של TSS. ב- BP סל גודל 100, זה חילוץ יש נתונים 81 פחים, ואת סל המרכז תואם את TSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הגן על גדיל antisense, להעיף באזור חילוץ משמאל לימין כך פחי הזרם הם תמיד PLACED בצד שמאל עם סקריפט Perl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לפצל באזור TSS ± ​​4 kb לשלושה אזורים תת: שמאל, נגד הזרם 4 kb כדי במעלה הזרם 2 kb; התיכון, מעלה kb 2 במורד הזרם; נכון, זרם 2 kb עד 4 קילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, לחלק את הספירה של קורא כל סל במספר הכולל של משולב ממופה קורא מחושב ב 3.3.3. הנורמליזציה תבטל את ספציפיים המדגם לקרוא הבדלים ומאפשרת להשוות את הקורא ברחבי מדגמים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להריץ את הסקריפט bash (כמצוין קובץ סקריפט) לבצע בדיקה סטטיסטית על מנורמל קורא המתקבל באזור שמאלה, כדי לזהות מתילציה הפרש בין קבוצה הנורמלית במקרה באזורים המתוארים באזור האגף. הערה: עיין קובץ הקידוד משלים את תסריט bash. בהתבסס על אזורים כי הם מפוגל דיפרנציאלי, ישנם שבעה שילובים: האזור כולו: מתילציה ההפרש ברחבי האזור kb ± 4 TSS MiddleLeft: מתילציה ההפרש בשני באזור האמצעי ויצא MiddleRight: מתילציה ההפרש בשני באזור באמצע וימינה מתילציה הפרש בשני באזור על ימין ועל שמאל: צלע מתילציה הפרש באזור נותר רק: שמאל מתילציה הפרש באזור נכון יחיד: תקין מתילציה הפרש באזור אמצעי יחיד: תיכון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו סקריפט bash כדי להמחיש את מתילציה דיפרנציאליים עלילת טורנדו. עלילת הגנים המפוגלים Hyper היפו בפנל נפרד, ולמיין לפי סדר שילוב באזור כמתואר 3.4, בהתאמה. </li></ol>

<ol>
	<li>Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+a+perspective+on+the+role+of+DNA+methylation+in+acquired+endocrine.">Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine.</a> Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).</li><li>Nair, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methyl-DNA+immunoprecipitation+(MeDIP)+and+methyl-CpG+binding+domain+(MBD)+protein+capture+for+genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveal+CpG+sequence+coverage+bias.">Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias.</a> Epigenetics. 6, 34-44 (2011).</li><li>Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+DNA+methylation+profiling.">Methods in DNA methylation profiling.</a> Epigenomics. 1, 331-345 (2009).</li><li>Clark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+whole+genome+approach+of+MeDIP-seq+to+the+targeted+approach+of+the+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip((R))+for+methylome+profiling.">A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling.</a> PLoS One. 7, e50233 (2012).</li><li>Walker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling:+comparison+of+genome-wide+sequencing+methods+and+the+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chip.">DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip.</a> Epigenomics. , 1-16 (2015).</li><li>Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+DNA+methylomes+from+microarray+to+genome-scale+sequencing.">Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing.</a> Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).</li><li>Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MBD-isolated+Genome+Sequencing+provides+a+high-throughput+and+comprehensive+survey+of+DNA+methylation+in+the+human+genome.">MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).</li><li>Brinkman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+DNA+methylation+profiling+using+MethylCap-seq.">Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq.</a> Methods. 52, 232-236 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LOcating+non-unique+matched+tags+(LONUT)+to+improve+the+detection+of+the+enriched+regions+for+ChIP-seq+data.">LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data.</a> PLoS One. 8, e67788 (2013).</li><li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMS:+a+web-based+system+for+visualization+and+analysis+of+genome-wide+methylation+data+of+human+cancers.">CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers.</a> PLoS One. 8, e60980 (2013).</li><li>Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W-ChIPeaks:+a+comprehensive+web+application+tool+for+processing+ChIP-chip+and+ChIP-seq+data.">W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data.</a> Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveals+estrogen-mediated+epigenetic+repression+of+metallothionein-1+gene+cluster+in+breast+cancer.">Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer.</a> Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).</li><li>Hsu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+hypomethylation+of+EpCAM-regulated+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+recurrent+endometrial+cancer.">Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).</li><li>Wang, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Distal+and+Genic+Methylation+in+the+Development+of+Prostate+Tumorigenesis+Revealed+by+Genome-wide+DNA+Methylation+Analysis.">Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis.</a> Sci. Rep. , (2015).</li><li>Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+profiling+of+DNA+modifications:+cytosine+methylation+and+beyond.">Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond.</a> Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).</li><li>Riebler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BayMeth:+improved+DNA+methylation+quantification+for+affinity+capture+sequencing+data+using+a+flexible+Bayesian+approach.">BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach.</a> Genome Biol. 15, R35 (2014).</li></ol>

פרוטוקול זה פותח במעבדות של ד&quot;ר טים הואנג וד&quot;ר ויקטור ג&#39;ין באוניברסיטת למדעי הבריאות מרכז טקסס בסן אנטוניו.

טכניקת MBDCap-seq היא גישת העשרת זיקת 3, נחשבת כאלטרנטיבה חסכונית כאשר חוקרים מחזורים עם מספר רב של חולים 15. הצינור המובא כאן מתאר גישה מקיפה מן רכש מדגם ניתוח נתונים ופרשנות. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא הגדרת הליך הגברת PCR כדי לשפר את יעילות PCR של האזורים המועשרים GC בגנום ...

תקנה אפיגנטיים של גנים באמצעות מתילציה DNA היא אחד המנגנונים החיוניים הדרושים כדי לקבוע את גורל התא על ידי בידול יציב של סוגי רקמות שונים בגוף 1. חוסר ויסות של תהליך זה כבר ידוע לגרום למחלות שונות, כולל סרטן 2. תהליך זה בעיקר יהיה כרוך בתוספת של קבוצות מתיל על שאריות ציטוזין ב CPG dinucleotides של DNA 3. ישנן כמה טכניקות שונות המשמשים כיום כדי לחקור את המנגנון הזה, שלכל אחד מהם יתרונות משלהם כפי שמתואר מחקרים רבים 2-8. כאן נדונו באחת הטכניקות הללו בשם מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), שבו אנו משתמשים בטכניקת העשרת זיקה לזהות אזורים מפוגלים של ה- DNA. טכניקה זו בונה על היכולת מחייב מתיל של החלבון MBD2 להעשיר עבור קטעי דנ&quot;א גנומי המכיל אתרים CPG מפוגל. אנו מנצלים ערכת העשרה DNA מסחרית מפוגלתעבור הבידוד של אזורים המפוגלים אלה. המעבדה שלנו הוקרנה מאות דגימות חולות באמצעות טכניקה זו וכאן אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה מקיף, אשר ניתן להשתמש בם כדי לחקור קבוצות גדולות של מטופלים. כפי שעולה עם כל טכנולוגית רצף של הדור הבא, MBDCap-seq גם דורש גישה ביואינפורמטיקה ספציפית על מנת לכמת את הרמות של מתילציה במדויק על פני הדגימות. נעשו מחקרים רבים שנערכו לאחרונה במאמץ כדי לייעל את תהליך הנורמליזציה וניתוח של נתוני רצף 9, 10. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים באחת השיטות הבאות יישום גישת התאוששות קריאה ייחודית - LONUT - ואחריו נורמליזציה ליניארי של כל דגימה על מנת לאפשר השוואות משוחדות על פני מספר רב של דגימות חולות.

<table><tbody><tr><td>Methylminer DNA enrichment Kit</td><td>Invitrogen</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus Sonication Device</td><td>diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate, pH 5.2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>Fully automated library construction system</td></tr><tr><td>Adapter Primers</td><td>Bioo Scientific</td><td>514104</td><td>PCR primer mix</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Fluorometric Quantitation System</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR Purification beads</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

מתילציה היא אחד השינויים אפיגנטיים החיוניים ל- DNA, האחראית על ויסות המדויק של הגנים דרושים התפתחות והתמיינות יציבות של סוגי רקמות שונים. חוסר ויסות של תהליך זה הוא לעתים קרובות סימן ההיכר של מחלות שונות כמו סרטן. כאן, אנו מתארים אחת טכניקות הרצף האחרונות, מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), המשמש לכמת מתילציה שונה רקמות בריאות ומחלות עבור קבוצות גדולות של מטופלים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של גישת העשרת זיקה זו יחד עם צינור ביואינפורמטיקה להשיג כימות אופטימלי. טכניקה זו נעשה שימוש כדי רצף מאות חולים ברחבי סוגי סרטן שונים כמו חלק מפרויקט methylome 1,000 (מערכת Methylome סרטן).

השתמשנו MBDCap-seq ללמוד שינויים מתילציה DNA במספר רב של חולים בסוגי סרטן שונים, כולל השד 12, רירית הרחם 13, הערמונית 14, וסרטן הכבד בין היתר. כאן אנו מדגימים כמה פרטים ממחקר סרטן השד פרסם 12 לאחרונה. במקרה זה, השתמשנו גישת רצף הגנום כולו לזהות איי CPG כי הם מפוגלים דיפר...

Watch this Scientific Journal Video about Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues at JoVE.com

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

methyl-binding-dna-capture-sequencing-for-patient-tissues

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

8.6K Views.  University of Texas Health Science Center at San Antonio.  כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן. 

Video: Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Biology

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Neuroscience

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Cancer Research

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioengineering

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video