노 보 Nordisk 기초 센터 기본 대사 연구를 위한 Novo Nordisk 기초에서 제한 없는 기부금에 의해 부분적으로 투자 코펜하겐 대학에서 독립적인 연구 센터입니다.

1. 제한 효소 처리
<ol><li>총 인간 DNA 제한 효소 BamHI 위치 14258 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에 상처를 치료 하 여 mtDNA를 선형화. 참고: 마우스 DNA 위해 아래와 같이 동일한 조건에서 제한 효소 BglII를 사용 합니다.</li>
	<li>각 샘플 mtDNA 메 틸 화 평가 한 0.2 mL 반응 관을 준비 하 고 (fluorometry에 의해 계량), 다음 믹스: 3 μ g 게놈 DNA를 추가 하는 15 μ 버퍼 3, 3 μ BamHI와 150 μ의 최대 물</li>
	<li>4 h 37 ° c.에 대 한 열 cycler에 있는 장소 관</li>
</ol>2. 황산 변환
<ol><li>BamHI 치료 DNA 나트륨 황산29설명 되어 있는 대로 사용 하 여 변환 합니다.</li>
	<li>200-500 ng BamHI 치료 DNA를 사용 하 여 각 변환 반응 20 μ의 전체 볼륨에 대 한. DNA 복구 50-70%입니다.</li>
	<li>황산 변환 DNA 10 μ 차입 버퍼에 elute</li>
	<li>Fluorometry에 의해 단일 가닥 DNA를 계량.</li>
	<li>선택 사항: 프로토콜의 나머지를 진행 하기 전에-20 ° C에서의 황산 변환 DNA를 저장 합니다. 장기 저장을 위한 저장-80 ° C에서의 황산 변환 DNA</li>
</ol>3입니다. 뇌관을 시퀀싱 하는 황산의 디자인
<ol><li>황산 시퀀싱 온라인 도구 Methprimer30 BiSearch31,32를 사용 하 여 뇌관 디자인. 참고: Methprimer 및 BiSearch 수 뇌관 바인딩 시퀀스 게놈 시퀀스에 대 한 검색 cytosines thymines 후 황산 처리와 유사 하 게 변환 됩니다.</li>
	<li>최적의 고 공평한 확대를 위한 뇌관에서 CpG 디를 방지 하 고 100-300 bp 사이 amplicon 크기를 디자인 합니다.</li>
	<li>설계 된 뇌관 뇌관 검색BiSearch의 함수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 DNA에 특정 인지 확인 합니다. 이미 설계 된 황산 변환 뇌관 삽입, 황산 상자 똑 딱 거리 고 PCR 매개 변수 및 참조 게놈을 포함. 참고: 가능한 PCR 제품의 목록이 표시 됩니다.</li>
	<li>복사 가기 1-5 뇌관 시퀀스 하 그들 oligonucleotide 종합에 대 한 주문 양식으로. 참고: 목록 인간 실험실에서 검증 된 마우스 mtDNA 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>황산을 사용 하 여 테스트 뇌관 PCR agarose 젤 전기 이동 법 4 단계에 설명 된 대로 다음 변환. 테스트와 별도로 모든 뇌관 쌍을 최적화 하 고 정확한 amplicon 크기 agarose 젤에 표시. 참고: 멀티플렉싱 뇌관, 필요한 경우 추가 하나에 여러 개의 뇌관 PCR 반응 단일 agarose 젤 전기 이동 법 또는, polyacrylamide 젤 전기 이동 법, 비슷한 제품을 구별 하는 것 같은 더 resolutive 방법에 PCR 제품을 시각화 크기입니다.</li>
</ol>4. 황산 PCR 및 젤 추출 변환
<ol><li>관심 영역을 증폭, 뜨거운 시작 Taq 중 합 효소를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 믹스 100 ng DNA, 500 µ M와 반대로 감각 뇌관, 1 µ L dNTP 믹스 (각 dNTP의 10 µ M), 그리고 50 µ L. 총 볼륨에 7.5 U/반응에서 중 합 효소를 변환 하는 간단히, 다음과 같은 조건 가진 PCR 실행: 95 ° C에서 5 분 (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 주기; 10 분 72 ° c. 별도로 프라이 머를 사용 하거나 다중화.</li>
	<li>선택 사항: 뇌관, 멀티플렉싱 사용 200 ng 변환 DNA와 자전거 다음과: 5 분 95 ° C (60 s 94 ° C, 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 주기; 10 분 72 ° c. 참고: 온도 뇌관의 녹는 온도 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>2 %agarose 100 볼트에 전기 이동 법 젤에 PCR 제품 주제.</li>
	<li>부드러운 자외선에서 메스와 PCR 제품을 추출 하 고 microtubes에 추가 합니다. DNA의 손상을 방지 하려면 과도 한 자외선에 PCR 제품을 노출 하지 마십시오. 노출 시간을 30 이상 하지 s.</li>
	<li>앞에서 설명한3젤 정화를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>4.5 단계에서 순화 된 DNA를 계량 fluorometry를 사용 하 여. 5 단계 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행</li>
</ol>5입니다. 황산 시퀀싱 라이브러리 준비
<ol><li>황산 변환 PCR 제품의 라이브러리 준비를 수행 합니다. 옵션:이 단계에서 PCR 제품 멀티플렉스할.</li>
	<li>최대 100을 사용 하 여 최종 복구 수행 PCR 제품의 ng. 0.2 mL 튜브에 55.5 µ L PCR 제품을 3 µ L 최종 준비 효소와 6.5 µ L 최종 수리 반응 버퍼 (10 배)를 추가 합니다. 장소 및 20 ° c에서 65 ° c.에 30 분 뒤 30 분에 대 한 열 cycler에 튜브를 품 어</li>
	<li>15 µ L 블런트/TA 리가 믹스, 2.5 µ L 최종 수리 DNA를 혼합 하 여 시퀀싱 어댑터 선 어댑터와 1 µ L 결 찰 증강. 사용 하는 경우 < 100 ng PCR 제품 입력으로 희석 어댑터 10 번.</li>
	<li>열 cycler에 믹스 (5.3 단계) 하 고 20 ° c.에서 15 분을 품 어 열 cycler 일시 중지 하 고 3 µ l 사용자 추가 튜브에 효소. 혼합 열 cycler에 다시 튜브를 배치 하 고 37 ° c.에서 15 분을 품 어</li>
	<li>크기는 DNA PCR 제품 크기에 따라 구슬의 다양 한 비율 단단한 단계 가역 동원 정지 (SPRI) 비즈를 사용 하 여 어댑터 출혈 DNA를 선택 합니다.</li>
	<li>5.4 고 55 resuspended µ L SPRI 구슬에서 어댑터 출혈 DNA를 13.5 µ L H2O를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 5 분 및 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 솔루션은 분명, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬이 들어 있는 튜브를 삭제. 참고:는 상쾌한 어댑터 출혈 DNA를 포함 하 고 큰 원치 않는 조각을 폐기 구슬에 바인딩됩니다.</li>
	<li>단계의 5.6는 상쾌한에 25 µ L resuspended SPRI 구슬을 추가 하 고 섞어 실 온에서 5 분 동안 품 어. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명 하다는 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 폐기 상쾌한 어댑터 출혈 DNA 구슬에 바인딩되어 반면 원치 않는 DNA를 포함 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 실행 하는 동안 씻어 구슬 200 µ L 80% 에탄올 (갓 준비)를 추가 합니다. 품 어 30 s 및 제거와 삭제는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>공기 건조 구슬 5 분에 대 한 튜브 오픈 뚜껑 마그네틱 스탠드에 있는 동안.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 23 µ L 차입 버퍼에 DNA elute 혼합. 2 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명, 이전 PCR 증폭 (단계 5.14)에 대 한 96-잘 PCR 접시에 2 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>PCR 증폭 (단계 5.17)에 대 한 새로운 0.2 mL 튜브에 나머지 약 21 µ L를 전송. 참고: 해야 하지 어떤 구슬 구슬의 다음 단계 효소 반응 억제 수 있습니다 전송 합니다.</li>
	<li>단계 5.14 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행</li>
	<li>RT-정량 어댑터 출혈 DNA 증폭에 필요한 사이클 수를 예측 하 여 사전-PCR 증폭을 수행 합니다. 반응, 당 96 잘 PCR에서 다음 접시 포함 2 µ L DNA (단계 5.11) 추가: 0.4 µ L 인덱스 뇌관, 0.4 µ L 범용 PCR 뇌관, 7.2 µ L H2O, 10 µ L 실시간 정량 마스터 믹스.</li>
	<li>실시간 PCR 기계에 접시를 놓고 다음과 같은 조건에 접시를 주제: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 주기; 5 분 65 ° c.</li>
	<li>사전 증폭 RT-정량 PCR 반응의 선형 단계의 끝에 해당 Ct 값에 한 Ct 값을 빼서 각 샘플에 필요한 증폭 사이클의 수를 견적 한다.</li>
	<li>혼합 하 여 단계의 5.12 어댑터 출혈 DNA 증폭: 21 µ L DNA, 25 µ L PCR 마스터 혼합, 1 µ L 인덱스 뇌관, 1 µ L 범용 PCR 뇌관 및 2 µ L H2o. 열 cycler에서 다음과 같은 조건에 각 샘플 제목: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [5.16 단계에서 계산 된 Ct] 주기; 5 분 65 ° c. 참고:만 샘플 당 하나의 인덱스 뇌관을 사용 하 여 멀티플렉싱 있도록 기억 해요. 인덱스는 PCR 동안 삽입 됩니다.</li>
	<li>증폭된 DNA SPRI 구슬을 정화 하 고 22 µ L 차입 버퍼에 elute.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 또는 대체 방법으로 라이브러리 품질을 제어 합니다. 올바른 라이브러리 피크 크기 (PCR 제품 크기 플러스 어댑터)를 찾습니다.</li>
	<li>얼룩 분석 라이브러리 제품의 평균 기본적인 쌍 크기 예측: 고급 전역 설정을 두 번 클릭 "테이블"에 얼룩 분석에서. 100-1000 bp에서 영역을 정의 하 고 확인을 클릭 합니다. 지역 테이블에서 정의 된 지역 나타나고 라이브러리 평균 크기 (bp) 계산 됩니다.</li>
	<li>Fluorometry에 의해 라이브러리를 계량. 6 단계 또는-20 ° c.에 게 라이브러리를 진행</li>
</ol>6. 다음 세대 시퀀싱
<ol><li>수식을 사용 하 여 라이브러리의 nM 농도 계산: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>라이브러리 같은 nM 농도 2 예 nM 희석 (선택 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 0.5 nM 라이브러리 농도 따라). 2 nM 라이브러리의 수영장을 달성 하기 위해 모든 라이브러리를 풀.</li>
	<li>변성 고 시퀀싱 악기 가이드 다음과 같은 라이브러리를 희석. 한마디로: 0.2 N NaOH 추가 하 여 2 nM 풀 변성 및 5 분 Dilute 오후 10의 최종 희석 변성된 풀에 대 한 실 온에서 품 어. 변성 고 오후 12 시 5의 최종 희석에 상용 컨트롤 라이브러리를 희석. 새로운 튜브 10 오후 수영장 20% 오후 12 시 5 컨트롤 라이브러리와 함께 혼합 한다. 참고: 황산 변환 매우 낮은 복잡성을 소개합니다. 20% 컨트롤 라이브러리 스파이크-에서 더 나은 품질의 시퀀싱 발생 합니다.</li>
	<li>깊은 시퀀싱 악기를 사용 하 여 150 bp 쌍-엔드 시퀀싱을 실행 합니다.</li>
</ol>7. 전산 분석-예상 메 틸 화 수준
<ol><li>.Fastq 파일 (sample1_R1.fastq.gz 및 sample1_R2.fastq.gz에 여기 라고 함)를 생성, 관심의 전체 게놈의 비스마르크 인덱스 생성 (여기에서 bismarkIndex라는 폴더) chrM의 게놈 시퀀스 fasta에 사용할 수 있는지 확인 하 고 형식 (여기서는 chrM라는 폴더에).</li>
	<li>어댑터 및 뇌관에 의해 소개 하는 바이어스를 제거에 전처리: Trim_galore33도구를 사용 하 여. 정방향 및 역방향 읽기의 5' 끝에서 2 개의 뉴클레오티드를 제거 합니다. trim_galore-clip_R1 2-clip_R2 2-o. /-쌍이 trim1-sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>전처리 된 읽기 비스마르크34 를 사용 하 여 전체 게놈에 정렬 비스마르크-사 개-빵-o. /. / bismarkIndex /-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz 참고: 다른 동기 기를 사용 하는 경우 고유 정렬 수 없습니다 읽기 삭제 됩니다 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>추출 읽고 염색체 M, Samtools35 를 사용 하 여 여기에 매핑 samtools 정렬-l 0-O BAM-o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools 인덱스 sample1_sorted.bam samtools 볼-u sample1_sorted.bam chrM | samtools 정렬-n-O BAM-o sample1_chrM.bam</li>
	<li>메 틸 화 정보 추출 bismark_methylation_extractor-p-cx는-cytosine_report-포괄적인-genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>.bedGraph는.cov 또는 CX_report.txt 파일을 사용 하 여 추가 분석을 위해. 시각화 및 테스트에 대 한 sample1_chrM.CX_report.txt 파일을 사용 합니다.</li>
	<li>수행 추가 전처리 단계에서 클리핑 영역이 여러 개를 심문 하 고 뇌관 바이어스 매핑 중 생성 M 바이어스 플롯에서 볼 수 있습니다. 자세한 내용은 대 한 비스마르크 설명서를 참조 하십시오.</li>
</ol>8. 전산 분석-차이의 테스트
<ol><li>CX_report.txt 파일 들어 염색체 M에 모든 c 7 열, 염색체 (여기 chrM), 위치, 스트랜드, 갠 읽기 수, unmethylated 읽기, C 컨텍스트 및 주변 시퀀스의 수를 확인 합니다.</li>
	<li>CX_report chrM 전체에서 커버, 증폭 되는 지구를 하위 집합을 확인 합니다.</li>
	<li>비 파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여 개별 c의 어 부의 정확한 테스트 등 전체 영역에 대 한 로그인 테스트 샘플 간의 차이 대 한. 참고: 정량화 될 것입니다 종종 0% 메 틸 화, 가까운 왜 정상 가정 적절 하지 않은 이유입니다.</li>
	<li>마찬가지로, 시각화, 시각화 quantiles 하거나 이항 비율 신뢰 간격을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS.">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).</li><li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-methylcytidylic+acid:+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells.">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li><li>Gama-Sosa, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA.">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li><li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA.">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li><li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans.">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li><li>Li, L. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin:+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies.">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li><li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing.">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li></ol>

저자는 선언할 수 없습니다 경쟁 금융 관심 있다.

여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.
우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 ?...

미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지1의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조2는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험3.
핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초4체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포5,,67에 모든 methylated cytosines의 25% 까지의 값으로 핵 DNA에 다양 한 금액에 존재.
시 토 신 메 틸 화는 핵 게놈의 널리 인정 하는 동안 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 존재가 여전히 논란. 첫 번째 연구 조사 mtDNA 메 틸 핵 DNA8에 비해 낮은 수준에 있지만 mtDNA 메 틸 화는 쉽게 탐지는, 경작된 한 세포에 수행 되었다. 인간과 murine 셀에서 mtDNA 메 틸 또한 낮은 수준 (2-5%)에서 발견 되었다. 갠 DNA immunoprecipitation (MeDIP) 뒤에 양이 많은 PCR 등 5 methylcytosine 캡처에 의존 하는 분석 실험을 사용 하 여, mtDNA 메 틸 화 다양 한 마우스와 인간에서 또한 검색 되었습니다 및 셀 라인9,10, 11,12. ELISA 분석 결과 또는 질량 분석 5-methylcytosine에 대 한 항 체를 사용 하 여, DNA 메 틸 화 상당한 수준의 순화 된 미토 콘 드리 아 분수13,,1415, 에서 발견 되었습니다. 그러나 16., 상기 연구에서 분석의 대부분 단일 기본 해상도에서 DNA 메 틸 화의 절대 정량화를 제공 하기 위해 설계 되지 않은 기술을 사용.
양적 및 resolutive DNA 메 틸 화 분석 단일 가닥 DNA 컨텍스트17 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 이용 하는 "황산 시퀀싱", 라는 기술에 의해 달성 될 수 있다 . 황산 시퀀싱에 사용 하 여, 연구의 별자리 시 토 신 메 틸 화 다양 한 수준에서의 존재를 감지 했습니다. D 루프 영역, 12S는 또는 16 지역에서 메 틸 화 mtDNA 인간18,19,20,21,,2223 와 마우스24 에서 쉽게 검색 되었습니다. 그러나 조직 및 세포,, 연구에 걸쳐 총 cytosines의 1-20%의 흥미로운 다양성으로.
이러한 수많은 연구에 비해 단지 몇 가지 연구, 우리의 그룹에서 mtDNA 메 틸3,25,,2627 의 존재를 제기 했거나 심문의 생물학 관련성 mtDNA (2%) 아래 레벨28의 매우 낮은 수준. 최근, 우리는 전체 미토 콘 드리 아 황산 시퀀싱3에서 잠재적인 황산 시퀀싱 아티팩트 관측을 했다. 우리는 메 틸 화 레벨을과 대 평가 함으로써 미토 콘 드리 아 DNA의 이차 구조는 황산 시퀀싱에서 false로 되었다면 이어질 수 있는 증거 제공. 여기 mtDNA의 황산-변환의 아티팩트를 방지 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 DNA의 간단한 효소 소화 mtDNA 보조 구조 발생 하 고 황산 황산 시퀀싱 프로토콜을 다음에 대 한 전체 액세스를 허용. 또한, 우리는 황산 시퀀싱의 분석에 대 한 동반 bioinformatic 파이프라인을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BamHI</td>
			<td style="width:164px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:113px;"># R0136</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ DNA methylation-lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td># D5030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit ssDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q10212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 203603&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7370S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td># E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td># A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Sensitivity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit high sensitivity dsDNA assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhiX control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td># 1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>#1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td># Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td># G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq instrument</td>
			<td>Illumina</td>
			<td># SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for accurate detection of mitochondrial dna methylation

DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.

이 프로토콜에 두 단계는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 중요 합니다. 1) 이차 구조 및 미토 콘 드리 아 DNA 특정 뇌관의 2) 디자인의 오프닝.
제한 효소 BamHI (그림 1) 인간의 게놈 DNA를 소화 하 여 미토 콘 드리 아 DNA 구조는 뉴클레오티드 위치 14,258에 삭감 될 것 이다 그리고 이차 구조를 열 것 이다.
<p class="jov...

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K 조회수.  University of Copenhagen. 여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...