המחברים מודים למתיאס פיטר וקבוצתו במכון לביוכימיה במכון הטכנולוגי בציריך שבו שיטות אלו פותחו. עבודה זו נתמכה על ידי שוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. מדידות מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות הלילה ב 5 מיליליטר בינוני סינתטית לOD 600 0.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות בדילול מלא ב30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי 3 מרוכז (0.6 M) פתרון NaCl במדיום סינטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 מ&quot;ג / מיליליטר של concanavalin (ConA) ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין ~ 200 μl של פתרון ConA לתוך השקופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת לעמוד במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון ConA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl H 2 O אל הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 600 OD של תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300 μl של תרבית תאים בOD 600 = 0.02 בmicrotube 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים באמבט מים במשך 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת מילcrotube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים באמבט מים במשך 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תרבית תאים לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 30 דקות כדי לאפשר לתאים ליישב לתחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף גם במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות תאורה עבור ערוץ הניאון שיירשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות התאורה לשתי תמונות בהירות שדה (אחד קצת מחוץ לפוקוס: 3 מיקרומטר מתחת למישור המוקד, כדי לאפשר פילוח נכון של התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מרווחי הזמן למדידת הזמן לשגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שדות מבט לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הרכישה של כמה מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את הרכישה להוסיף ל0.6 בינוני M NaCl 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים הדמיה. </li></ol> 2. מדידות זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמצעיOD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות הלילה ב 5 מיליליטר בינוני סינתטית לOD 600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות כדי להגיע 600 OD של 0.2-0.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון cycloheximide בH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי 3 מרוכז (0.6 M) פתרון NaCl במדיום סינטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן microtube 1.5 מיליליטר אחד עם של 0.6 בינוני M NaCl 100 μl עבור כל נקודת זמן כדי להימדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן 0, להוסיף 200 μl של תרבית תאים לכל microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הרועד ב30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן t, להוסיף 30 cycloheximide μl לmicrotube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.11 עבור כל נקודות הזמן הרצויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל microtubes לפחות 45 דקות ועד 3 שעות ב30 ° C עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות FACS עם 400 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים באמבט מים במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת microtubes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בןicate התאים באמבט מים במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת microtubes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 תרבית תאי μl מmicrotube לצינור FACS המקביל שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את לייזר 488 ננומטר עירור ו530/30 מסנן bandpass ננומטר לצורך זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן אינו מביע ומבטא באופן מלא לדוגמא כדי לוודא אם הם נופלים בטווח רגישות גלאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 10,000 תאים לכל דגימה שנרכשה. </li></ol>

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מיקרוסקופית הטיפול בהיטב עם ConA הוא צעד חיוני כדי להבטיח הדמיה תקינה של התאים. בגלל ConA יש מסיסות נמוכה ב PBS (5 מ&quot;ג / מיליליטר), תהליך הסינון מאפשר הסרת אגרגטים גדולים שנמצאים בפתרון מסונן ולהפריע להדמיה. תאים לצרף יחסית חזק אל פני הש?...

איתות באמצעות מפלי התמרה לעתים קרובות מגיע לשיאו בביטוי של חלבונים. אפיון פרופיל ביטוי זה הוא מרכיב מפתח בהבנת התפקיד של מסלולים ביולוגיים. זיהוי של הספקטרום של חלבונים והדינמיקה של ההפעלה שלהם מוסדר עד יכול להיות מושגת על ידי טכניקות שונות, כגון מיקרו מערכים, כתמים הצפוניים או כתמים מערביים 1-3. עם זאת, טכניקות אלו הן בממוצע התגובה של אוכלוסייה שלמה של תאים. כדי להבין את הרגולציה הקנס של הביטוי של חלבונים, רצוי לאסוף מדידות ברמת התא בודדת. באופן אידיאלי, מדידות אלה אמורות גם לספק נתונים כמותיים נוחים לפתח מודלים מתמטיים של המסלול הבסיסי. מיקרוסקופית וcytometry זרימה הן שתי טכניקות, שמתאימים באופן אידיאלי כדי לספק מדידות תא כזה כמותית אחת. תיוג אנדוגני של חלבונים בחלבון פלואורסצנטי יכול bדואר משמש לכמת רמת הביטוי שלהם 4. עם זאת, מאחר שהתוספת של מחצית ניאון גדולה בתחנה הסופית של החלבון יכולה להבהיר את זה שאינו פונקציונלי, הוא לעתים קרובות רצוי יותר כדי ליצור כתבי ביטוי ספציפיים המבוססים על אמרגן הנהיגה הביטוי למבנה ניאון. חלבון הכתב הזה הוא חיצוני למערכת הסלולרית, ולכן אינו משפיע על אירועי איתות המתרחשים בתא. מיקרוסקופיה וcytometry זרימה שניהם הייתה בשימוש נרחב בתחום איתות השמרים. כדוגמאות; קולמן-לרנר ועמיתים לעבודה מתואמת, בתאים בודדים, הביטוי של הזדווגות כתבים ספציפיים והביעו constitutively על ידי מיקרוסקופ לכמת את הרעש במפל הולכים אותות שמרי הזדווגות 5, Acar ועמיתיו השתמשו cytometry זרימה ללמוד את רשת הרגולציה שליטה על הביטוי של גנים GAL 6. במחקר קודם 7, השתמשנו combinatiבשתי הטכניקות הללו כדי ללמוד את פלט הביטוי מגליצרול osmolarity הגבוה המסלול (HOG) בניצני שמרים. מסלול קינאז חלבון זה mitogen הופעל (MAPK) מופעל על ידי מתח Hyper-האוסמוטי. התוצאה הוא ההפעלה של Hog1 MAPK, אשר translocates לגרעין התא כדי לגרום לתכנית תעתיק וכתוצאה מכך הביטוי של בערך 300 גנים. ללמוד את התהליך הזה, היינו לנו מהונדס כתב ביטוי המבוסס על אמרגן STL1 (גן המושרה באופן ספציפי בתגובה לפעילות Hog1 8) נהיגה הביטוי של חלבון מרובע ונוס ניאון (עמ &#39;STL1-ע&quot;ע). Cytometry זרימת מדידות חשפו את נוכחותם של שתי אוכלוסיות של תאים ברמה בינונית מתח (0.1 M NaCl) עם רק חלק קטן מהאוכלוסייה המבטאת את כתב הניאון. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ כדי לחקור את ההתנהגות הזאת עוד יותר וגילינו שהרעש הזה בביטוי חלבון היה נשלטת על ידי גורמים פנימיים 9. אנחנו could להתבונן עוד כי תאים עם רמה דומה של פעילות Hog1 יכולים להציג תוצאות ביטוי שונות לחלוטין. השילוב של שתי טכניקות אלה אפשר לנו להדגים כיצד שיפוץ האיטי של גנים תגובת לחץ השפיע על תוצאת הביטוי ברמת התא הבודד 7. במאמר זה, אנו משתמשים בביטוי של כתב STL1-ע&quot;ע עמ &#39;הנגרם על ידי הלם Hyper-האוסמוטי כדוגמא לכימות של ביטוי חלבון על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. אותו הזן נתון 0.2 מתח M NaCl נחקר בשני הטכניקות. זה יאפשר לנו להדגיש כמה הבדלים עיקריים בשתי טכניקות משלימות מאוד אלה.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>ForMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM amino-acid mix</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Incubation chamber</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence light source</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8-well-slide </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Matrical bioscience</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

כימות של ביטוי גנים ברמת התא הבודד חושפת מנגנוני ויסות רומן מטושטשים במדידות שבוצעו ברמת האוכלוסייה. שתי שיטות מבוססות על מיקרוסקופיה וcytometry זרימה מוצגות כדי להדגים כיצד ניתן לרכוש נתונים כאלה. הביטוי של כתב ניאון המושרה על שפעול מסלול MAPK גליצרול הגבוה osmolarity בשמרים משמש כדוגמא. היתרונות הספציפיים של כל שיטה מודגשים. Cytometry זרימה מודד מספר גדול של תאים (10,000) ומספק מדידה ישירה של הדינמיקה של ביטוי החלבון העצמאי של קינטיקה ההבשלה האיטית של חלבון פלואורסצנטי. הדמיה של תאי חיים על ידי מיקרוסקופ היא לעומת מוגבל למדידה של הטופס התבגר של הכתב בפחות תאים. עם זאת, ערכות נתונים שנוצרו על ידי טכניקה זו יכולה להיות עשיר מאוד הודות לשילובים של כתבים רבים ולמידע המרחב ובזמןהמתקבל מהתאים בודדים. שילוב של שתי שיטות מדידה אלה יכולים לספק תובנות חדשות על הרגולציה של ביטוי חלבון על ידי איתות מסלולים.

מיקרוסקופית תאי שמרים הנושאים את כתב ביטוי p STL1-ע&quot;ע (7 ySP9) הוצמדו לחלק התחתון של השקופית היטב והניחו מתחת למיקרוסקופ. התאים היו מגורה על ידי התוספת של מדיום מתח ישירות לתוך הבאר במהלך פגישת ההדמיה. זה מאפשר לנו לרכוש כמה ...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.5K Views.  University of Lausanne.  שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים. 

Video: Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Biochemistry

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...