We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. לבנות ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סורק עם רזולוציה אופטית: 4,800 dpi; רזולוציה חומרה: 4,800 x 9,600 dpi; עומק צבע קצת: 48 ביט, שיכול לפעול ברמות טמפרטורה והלחות הרלוונטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש צלחות פטרי בהיקף משמעותי, בניגוד לנייר משמש בדרך כלל על סורקים מסחריים. המושבות לשכב על גבי השכבה אגר, כ 5 מ&quot;מ מעל פני השטח של הסורק. הערה: עבור רוב סורקי המושבות תהיה בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברות סורק מסוימות אינן מאפשרות חיבור של יותר ממופע אחד של סורק מאותו הסוג לאותו מחשב. ודא שסורק יותר מאחד יכול להיות מחובר ומזוהה באופן ייחודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האביזרים כמפורט להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיסות שחורות סטרילי להכין הרגישו בד כדי לכסות את הצלחות (איור 1 שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להחזיק את צלחות פטרי במקום, להכין מחזיקי לבנים צלחת (חומרים ושיטות) שמתאימים סורקים ושיש להם 6 חולes בגודל של המנות (איור 1 שלב 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך לצמיחה של מיקרואורגניזם, לשים את הסורקים בסביבה מבוקר טמפרטורה. חבר את הסורקים למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: חיבור הממסר למחשב ולעקוף את מתג הפעלה / כיבוי של הסורק כדי להתגבר על שיפוע טמפרטורה. הערה: יחידת הממסר למיקרואורגניזמים מאוד רגישה לטמפרטורה. זה מכבה את הסורק כך שהאלקטרוניקה לא לחמם את פני השטח בצורה לא אחידה. שימוש רק בחלק ממשטח הסורק יכול להשיג תוצאות דומות. </li></ol> 2. התקן את מנהל הסריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את כל קבצי היישום &#39;סריקת מנהל&#39; לתוך ספרייה ייעודית מhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תצורת קובץ ScanningManager.exe.config לפי שמות הסורקים כפי שהם מופיעים בניהול-&gt; מנהל-&gt; התקני הדמיה מכשיר למחשב ( <strong&gt; איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון בעיות של היישום &#39;מנהל סריקה&#39;, לראות את לקרוא לי קובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיעוד נוסף על היישום &#39;מנהל סריקה&#39;, ראה Documentation.html. </li></ol> 3. לבצע ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות פטרי (איור 1): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבות לכ -2,000 CFU / מיליליטר. פלייט 0.1 מיליליטר של התרבות אחידה על פני השטח הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל קונטרסט טוב בין המושבות והצלחת ולספוג לחות, מכסה את הצלחת עם חתיכה השחורה סטרילי הרגיש בד. שים את המכסה על הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות במחזיקים בסורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מנהל הסריקה (איור 3): בחר את הסורקים משתתפים מהרשימה של סורקים מצורפים. בחר את מספר התמונות שיש לנקוט (חזרות), מרווח הזמן בין התמונות הבאות (פער זמן), ועיכוב הזמן לפני שמתחיל tהוא להתנסות (התחל אחרי). </li></ol> 4. ניתוח של תמונות הערה: קווי המתאר של שיטות חישוביות מסופקים לניתוח התמונות בMATLAB באמצעות &quot;ScanLag&quot;, שהוא זמין באופן חופשי לשימוש לא מסחרי בhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. פונקציות נוספות זמינות מפורטות בתוכנה ידנית, וקוד דוגמא הוא בתוספת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את התמונות מסורק בתיקיות נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות החלון הפקודה של Matlab, הפעל את הנהלים הבאים. הפרמטרים הנדרשים כדי להפעיל נהלים אלה מוגדרים בתוכנה ידנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PreparePictures לבצע עיבוד מקדים: בעיבוד מקדים, תמונות מסורק מיושרות. בכל צלחת פטרי תיחתך מרצף של תמונות. הזמן שבו כל תמונה נאספה מאוחזר מחותמת הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TLAllPlates להפעיל כדי לבצע זיהוי ומעקב בדוארצלחת פטרי אח בנפרד, מושבות זוהו והוקצתה מספר זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של הנתונים שחולצו: הגדלים של כל מושבה זוהתה נמדד כפונקציה של זמן. כדי לחלץ את הפצת ההופעה של המושבות להשתמש בפונקציות הבאות בחלון הפקודה של Matlab (מידע נוסף זמין בתוכנה הידנית): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ScanLagApp כדי להציג את הניתוח של צלחת פטרי לצד מסוימת בגרף של מושבות גודל לעומת זמן (איור 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במחוון כדי לשנות את השעה הנוכחית של הצלחת. גם העיתוי יהיה מצויינים על ידי קו אנכי התאמה על גרף אזור מושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מושבה כדי לראות העקומה הקשורים אליו, ולהיפך, לחץ על עקומה למצוא המושבה הקשורים אליו. לאחר שזיהה את המושבה, הפנוטיפ יכול להאסף על ידי לקטוף את המושבה מצלחת פטרי שזוהתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פגמים סינון בניתוח האוטומטי על ידי צ&#39;ולשיר מושבה ולחיצה על לחצן שלא לכלול. כאשר לחיצה להוציא את המספר של המושבה תהפוך צהובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעובר את התוצאות של הניתוח של כל צלחת, לסכם את התוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל AddHistograms ליצור היסטוגרמה של זמני מראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל plotDeathCurve ליצור ייצוג עקומת הישרדות של ההפצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל GetAppearanceTimes כדי לקבל את זמן ההופעה של כל המושבות בניסוי. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phenotypic+characterization+of+bacteria.">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li><li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Nature+of+Bacterial+Lag.">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria,+with+special+reference+to+continuous+culture.">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li><li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis.">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li><li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies.">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes.">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li><li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics.">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li><li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis.">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li><li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations,+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells.">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li><li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age.">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner.">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שיטות מיקרוסקופיות המבוססות על התבוננות ישירה נחשבות לעתים קרובות &quot;סטנדרטי זהב&quot; לחקר תא בודד התנהגות. ScanLag, המאפשר מדידה של חלוקת פעמים בפיגור באוכלוסיות חיידקים, מספק נתונים בהסכם טוב עם החלוקה שהתקבלה מניתוח תא בודד ומשיג הנתונים הסטטיסטיים גבוהים בהרבה. כמה שלבים קריטיים צריכים להתבצע בשיטה זו כדי לעבוד היטב: ראשית, לא מתפשר על הרזולוציה של הסורק, שאמורה להיות 4,800 x 9,600 להשיג תמונות טובות. שנית, להיות מודע לכך שללא מודול ניהול צריכת החשמל (שלב 1.6), שיפוע הטמפרטורה עלול להתפתח על פני השטח השטוח ומשפיע על צמיחה. צעד חשוב נוסף הוא הסינון של ליקויים כגון אבק שייתכן שנספרו בטעות כמושבות על ידי התוכנה. חיסור הרקע המובנה של התוכנה בדרך כלל מתגבר על פגמים אלה, אבל יש לי מושבות לפעמים &quot;שקר&quot; ללהיות מסונן באופן ידני. השלבים לפתרון בעיות העיקריים עשויים לטפל וריאציה בין צלחת בהתקנה, בשל מספר סיבות: (א) שיעור הצמיחה של מיקרואורגניזמים מושפעים טמפרטורה. תנאי טמפרטורה ולחות שונים יכולים להתרחש עקב אוורור או מיקום לא אחידים של המנה בחממה. (ב) האלקטרוניקה של הסורק עלולה להתחמם ולגרום לשיפוע טמפרטורה על פני השטח של הסורק. איור 10 מראה את ההשפעה של שיפוע חום מרחבית כגון בחיידקי Bacillus, יחד עם המדידות של הטמפרטורה על פני השטח הסורק לפני ו לאחר יישום מודול ניהול צריכת החשמל (שלב 1.6). שים לב שמודול זה לא יכול להיות הכרחי לסורקים חדשים יותר, ואם רק חלק ממשטח הסורק משמש, ניהול צריכת חשמל עשוי להיות מיותר. (ג) צלחות עם אטימות של חומר מזין אגר שונות עלולות להוביל לרמות זיהוי שונות. איור 11 מופעים הסובלנות דואר לכרכים שונים של אגר מזין כי תוצאת אטימות שונות. בניסוי טכניקת ScanLag היא קלה לביצוע ודורשת רק לצלחת מיקרואורגניזמים על צלחות פטרי סטנדרטיות, ולמקם אותם על פני השטח של הסורק. התוכנה שפותחה שולטת על ההליך כולו. רכישת התמונה נעשית באופן אוטומטי, וניתוח התמונה למעקב מושבה הוא גם אוטומטי. יתר על כן, המערכת יכולה להיות מדורגת למעלה כדי למדוד תנאים רבים ושונים באותו הזמן. לבסוף, השיטה מסתמכת על סורקי משרדים ומסחר, ולכן היא בעלות נמוכה. טכניקה זו ניתן להרחיב את המחקר של מיקרואורגניזמים השונות מE. coli K-12, עם זאת כמה שיקולים צריכים להתבצע. ראשית, השפעתה של מושבות המופיעות בשלב מוקדם במאוחר אלה יש להעריך, כפי שתואר בפירוט בפרסום קודם 7. עבור א &#39; Coli K-12,צפיפות המרבית של CFU לכל צלחת היא 200. זנים אחרים עם גדלים שונים של מושבות, ולדבר לחצות אפשריים אחרים בין מושבות, עשוי לחייב צפיפות שונה. שנית, הניתוח של הצלחות הוא מכויל לסף מבוסס תוכנה ספציפית שעשויות צריך להיות שונה, בהתאם לניגוד בין המדיום המוצק והמושבות. התוכנה יכולה להתארך גם כדי לחלץ מאפייני מושבה אחרים, מעבר לפיגור וקצב צמיחה. קוד התוכנה פתוח והוא יכול להיות שונה כדי לחלץ צורת מושבה, בהירות, חלקות וצבע. כי מדידות מבוצעות על מושבות שמקורם תאים בודדים, הנתונים חושפים פנוטיפים חדשים שלא ניתן למדוד על ידי מדידות ברמת אוכלוסייה. החשיבות של חלוקת זמן ההשהיה מתגלה בנוכחות של אנטיביוטיקה. אנטיביוטיקה רבות ידועות להיות יעילים רק נגד תאים הולך וגדל; לכן, כל עוד תאים נשארים בשלב הפיגור ולא גדלים, הם פרוtected מהשפעות של אנטיביוטיקה אלה 21. כאשר המספרים של חיידקי ניצול מוערכים במרווחי זמן במהלך טיפול אנטיביוטי 15,22,23, subpopulation של חיידקים, הנקרא persisters, מתגלה לעתים קרובות. במקרים מסוימים, חסינות לטיפול אנטיביוטי נובעת מפיגור ממושך. שימוש בהגדרה זו, הפיגור הזה מתגלה ולעתים קרובות יש חלוקת הלא טריוויאלי 24 (איור 6). שיטה זו גם מאפשרת שליפה של מוטציות נדירות. לדוגמא, לאחר ציפוי אוכלוסיית mutagenized, ניתן לזהות מוטציות המבוססות על הפנוטיפ ומבודד באופן ישיר, ללא בחירה. ההתקנה יכולה גם לעקוב אחר תאי תאי אינטראקציות על ידי מדידת הצמיחה של מושבות כפונקציה של צפיפות מושבות סמוכות ולכמת תופעות כגון חישת מניין או ההתפשטות של חיידקים שורצים. מידע רב ממדי שנחשף על ידי ניסויים עתידיים בשיטה זו יוביל לאפיון טוב יותר של אוכלוסיית חיידקיםים ולהתקדמות במחקר רפואי וסביבתי.

חיידקים התפתחו להגיב להרבה מצבים מלחיצים. תכונה כללית של הסתגלות ללחץ היא שינוי ב1,2 דינמיקת צמיחה. דינמיקת צמיחה מאופיינת בעיקר על ידי שני פרמטרים: קצב מעריכי צמיחה וזמן ההשהיה, כלומר את הזמן הדרוש כדי להסתגל לתנאים חדשים. בעוד מספר רב של שיטות תפוקה גבוהה להתמקד במדידות של קצב הצמיחה, זמן ההשהיה הוא לעתים קרובות פרמטר להתעלם, למרות שזה הפרמטר הקריטי לאפיון של ההסתגלות לתנאים חדשים. כימות של ההסתגלות לתנאים משתנים באופן מסורתי מתבצעת באמצעות שיטות ידניות מייגע 3,4. לאחרונה, טכניקות מתקדמות פותחו לצורך הניתוח של תאים בודדים 5,6. עם זאת, זה עדיין קשה להבחין צמיחה נורמלית לאחר עיכוב בצמיחה (כלומר זמן השהיה) 2,3 מצמיחה איטית. שיטה אוטומטית נבנתה, 7 ScanLag, כדילהפלות בין שני פנוטיפים דומים אלה. דוגמא בולטת לחשיבותו של המחקר של התפלגות זמן ההשהיה מתגלה תחת טיפול אנטיביוטי. רבים באנטיביוטיקה ולחצים אחרים להרוג תאים רק הולך וגדל באופן פעיל, ולכן תאים שהם &quot;מפגרים&quot; מוגנים 8. כדי לפקח על זמן השהיה, ניתן לראות תאים בודדים תחת מיקרוסקופ ולפקח על זמן הליגה ראשונה. חסרון עיקרי של שיטה זו הוא שטווח הזמן הדינמי הוא מוגבל; אותם תאים שגדלים מוקדם לכסות את פני השטח בקצב מעריכי, בצורה יעילה ומקטין את הצמיחה של תאים עם זמן שהייה ארוך יותר. שימוש בזרימת תאים מעט עוקפת 5 הזה, אבל מספר מוגבל של תאים יכול להיות במעקב ואת החלק היחסי של חיידקים שיציאה משלב הפיגור אחרי רוב האוכלוסייה החלה גובר לא ניתן לצפות. למרות מגבלות אלה, מספר מחקרים העריכו את ההשפעה של הרמה different מדגיש על חלוקת זמן השהיה באמצעות מיקרוסקופ תא בודד 9-12. דרך נוספת כדי לפקח על חלוקת זמן השהיה היא באמצעות מדידות עכירות 13,14. תרבויות רבות במקביל, כל אחד התחילה מתא בודד, הם גדלו בקורא צפיפות אופטי המודד את מספר החיידקים בתרבית לאורך זמן. שיטה זו מוגבלת על ידי הדיוק של הניפוח ולמספר הבארות בצלחת. שיטה אוטומטית שפתחה, בשם ScanLag, המאפשרת פעמים בפיגור והפצות זמן צמיחה להיות מוערכים, אפילו עבור אחוז הקטן של חיידקים באוכלוסייה שיש לי פעמים בפיגור רבות מאוד. השיטה מבוססת על זיהוי של מושבות על צלחות אגר מזין קונבנציונלי 15 (איור 1). כדי להפוך את זיהוי 16,17 מערך של סורקים מסחריים 18 שמופנים על ידי תוכנה בבית לרכוש מעת לעת תמונות של הצלחות, היה מהונדס. תוכנה הייתהנועד לנתח את התמונות באופן אוטומטי ולחלץ פרמטרים כמותיים 19,20, כגון זמן של ההופעה בכל פעם שמושבה והצמיחה של כל מושבה, אשר מוגדרת כאן כזמן לגדול מ20 פיקסלים 80 פיקסלים. כאן אנו מציגים את השיטה בפירוט, כולל ההתקנה של המערכת והשימוש בתוכנת ניתוח תמונה האוטומטית אשר שופרה עם ממשק משתמש טוב יותר. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למדידת מאפיינים אחרים של מושבות, כגון מורפולוגיה וצבע. מדידה של סוגים אלה של פרמטרים תאפשר השימוש של המערכת בPhenomics הרב ממדי. כשיטת מזהה מושבות של תאים בודדים, המערכת יכולה לחשוף פנוטיפים חדשים שלא ניתן למדוד על ידי מדידות ברמת אוכלוסייה. הטכניקה מאפשרת איתור ואחזור של גרסאות נדירות, ומאפשרת הקרנה של תכונות הרצויות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

כדוגמא למיצוי חלוקת זמן השהיה, איור 5 מראה את היכולת של ScanLag לזהות ולעקוב אחר כל מושבה עם מאפיינים ספציפיים על לוח אחד לאורך זמן, כפי שניתן היה לעשות בassay הקרנה. כאשר התרבות של מיקרואורגניזם היא הטרוגנית, האוכלוסיות השונות עלולות לחשוף את עצמם במהלך assay. לדוגמא, איור 6 מציג את כימות מראה ובכך חושף את חלוקת זמן ההשהיה bimodal בזן מוטנטי של א &#39; coli. קצב הגידול של התאים משפיע על זמן הופעתה של המושבה. כאשר מושבות לגדול באותו קצב, את המראה מאוחר ניתן לייחס לזמן ההשהיה (איור 7). כדי לאמת שהשיטה אכן מודדת את זמן השהייה של תאים בודדים, השווינו תוצאות עם אלו המתקבלות ScanLag באמצעות מיקרוסקופ תא בודד; אימות זה היא יורדribed בפירוט בפרסום קודם 7. שיטה זו מאפשרת ניטור של רבים יותר תאים מאשר יכול להיות מוערך במיקרוסקופ. ההפצות שהושגו באמצעות מיקרוסקופיה והושג באמצעות ScanLag חופפות במידה רבה. הפצת ScanLag היא מעט רחבה יותר; ניתוח תיאורטי לחזות ההרחבה להיות מסדר גודל של סטיית התקן של זמן החלוקה. אם זמן צמיחה הוא שונה עבור כל זן, מקורו של העיכוב בהופעה חייב להיחקר יותר בשיטות אחרות. ההשפעה של מושבות המופיעים מוקדם במראה של מושבות מאוחר יותר נבדקה. ניסויי בקרה 7 אישרו כי הופעתו מאוחר יותר לא נפגע כל עוד את המספר הכולל של מושבות בכל צלחת לא יעלה על 200 (איור 8). ניסוי שליטה נוסף אישר כי מיקומה של המושבה על הצלחת לא היה משפיע על זמן ההופעה שלה 7. הניתוח של plates הוא מכויל לסף מסוים שאולי צריך שינוי בהתאם לחומרים מזינים הנמצאים במצע גידול או הסוג של בקטריה. עם זאת, הניתוח הוא די חזק למגוון גדול של ספים כפי שמוצגים באיור 9. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. תרשים סכמטי של השלבים הדרושים ליצירת הפצת מראה מושבה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. צילום מסך של מנהל ההתקנים מראים את השמות של הסורקים המצורפים, ושל קובץ התצורה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסה של נתון זה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. צילום מסך של מנהל הסריקה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. צילום מסך של ScanLagApp. תמונה של הצלחת היא בחלונית הימנית, ועקומות הגדילה של כל מושבה נמצאות בחלונית הימנית, כמפורט במדריך. הקוצים בחלק מעקומות אזור המושבות להתרחש כאשר שתיים או יותר מושבות למזג. כאשר ההתמזגות של מושבות קורה, השטח של מושבות אלה נחשב כמשותף באזור. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. תוצאת נציג הניתוח של צלחת אחת. () תמונה של הפלט של יישום זיהוי בסוף הניסוי. כל אזור מושבה מזוהה, צבעוני והוקצה עם מספר זיהוי ייחודי. החיצים מצביעים על מושבות נציג נמדדו בב &#39;המושבה מזוהה מבוססת על סף עוצמה (למושבות החיידק על אגר LB או אגר M9 סף זה הוא 0.03. לתקשורת או חיידקים אחרים, סף זה יכול להיות מותאם בProcessPictures הפונקציה ). רק אובייקטים מעל 10 פיקסלים נספרים (סף זה יכול להיות שונה בMatchColonies הפונקציה). זיהוי של מושבה מתחיל בכ 10 5 חיידקים. מגרשים (ב &#39;) באזור בפיקסלים לעומת הזמן של ארבע מושבות נציג בצלחת זו. &quot;זמן המראה&quot; של כל מושבה הוא כאשר המושבה מזוהה. &quot;זמן הצמיחה&quot; של כל מושבה מוגדר כאן כזמן לגדול לכאן ולכאןמ &#39;20 פיקסלים 80 פיקסלים (גבולות אלה הם מתכוונן באמצעות הפונקציה getAppearanceGrowthByVec). התוכנה אינה כוללת את המושבות שהתמזגו לפני שהגיע לגבול העליון. זיהוי של מושבה ספציפית לפי מאפייניו הוא הודות קל את מספר זיהוי ואת הצבע שהוקצה לכל מושבה. לדוגמא מושבות # 1, 56, 77 ו124 מודגשים בשני הגרפים. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. כימות מראה יכול לחשוף חלוקת זמן השהיה bimodal. השוואת היסטוגרמות ניתוח ScanLag פעמים מראה לשני זנים שונים. קו כחול: מתח סוג בר אקספוננציאלית גובר (סה&quot;כ: 1,320 מושבות); המוטציה קו אדומה גבוה התמדה מועשרת בחיידקים מפגרים (סה&quot;כ: 1,529 מושבות). () היסטוגרמות מראה מנורמלות. השיאהופעה של תאים גדל באופן אקספוננציאלי הוא הזמן האופייני לגדול למושבה לזיהוי. הבלעה: אותו היסטוגרמה של הזן מוטנטי לאחר הפחתת הזמן של השיא של תרבות מעריכי כדי לקבל את זמן השהיה בפועל על פחים ברווח יומן המציגים את התפלגות זמן ההשהיה bimodal. (ב) פונקצית הישרדות של אותם נתונים כמו ב() בקנה מידת לוגריתמים. ייצוג זה משפר את זנב ההופעה המאוחר של המתח שעבר מוטציה. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. הפצת מראה וחלוקת זמן צמיחה. (א) ו (ב) מראים שתי היסטוגרמות ממדיות של זמן המראה וזמן הצמיחה של שני תנאים שונים (התוכנה אינה כוללת מושבות שהתמזגו לפני שהגיע לגבול העליון). (ג) השוואה בין היסטוגרמותשל שני הזנים להראות את ההבדל בזמן הופעה, ואילו הפעמים הצמיחה (ד &#39;) הן דומות. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8. המראה של מושבות מוקדמות לא מפריע למראה של מושבות מאוחר יותר. () ל&quot;ג בהפצה של wild-type תאים מצופים לבד זמן. (ב) ל&quot;ג בהפצה של זן רגיש קר לבד זמן, לאחר העברה לטמפרטורה מתירנית. (ג) ל&quot;ג בהפצה של שני הזנים מצופים יחד תחת אותם תנאי זמן. הקו השחור מייצג את ההתפלגות הצפויה המבוססת על נתונים המתקבלים בעת מדידת כל זן בנפרד. טובgreement בין הפצות צפויות ונמדדו מתקבל כל זמן שהמספר הכולל של מושבות בכל צלחת הוא מתחת 200. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. איור 9 סף הגילוי אינו משפיע על צורת התפלגות מראה המושבה הפצת מראה המושבה נותחה עבור אותו סט נתונים באמצעות שני גדלי סף שונים; (א) גודל סף הוא 10 פיקסלים; גודל סף (ב &#39;) הוא 50 פיקסלים. מספר התאים להיסטוגרמה: כ. 1,500. סף הגילוי שונה תוצאות רק בשינוי של זמן זיהוי. <img alt="איור 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> איור ACR מדידות יציבות 10. טמפרטורהתמונת פני השטח של הסורק ה-OSS. (א) לצלחת עם מושבות של subtillis Bacillus גדל על הסורק ללא ניהול צריכת חשמל. פני השטח הוא חם יותר בתחתית ולכן המושבות לצמוח מהר יותר. הקו ההדרגתי לצד הצלחת הוא ייצוג סכמטי של שיפוע החום. (ב) יציבות הטמפרטורה נמדדה עם שני צמדים ממוקמים על פני השטח של הסורק. הסורק מתחמם במהלך כל סריקה ומעל הזמן. (ג) עם ניהול צריכת חשמל, הטמפרטורה אחידה והמושבות לגדול בשיעורים דומים. (ד) אותו כ( ב &#39;) עם מודול ניהול צריכת החשמל. יציבות טמפרטורה של ± 0.2 ° C. <img alt="איור 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> איור 11. הבדלים בהתפלגות המראה יכולים להיות בגלל differences בהיקפי בינוני מוצק. אותה תרבות החיידקים הייתה מצופה על צלחות עם כמויות שונות של אגר LB, וכתוצאה מכך לגובה של משטח אגר שונה. הגבהים השונים הובילו לאטימות שונות של הצלחות, ולכן זמן זיהוי שונה. ההבדל בין הצלחות נבדק ואת ההבדל בין תנאי גובה שונים. (א) הבדלים אופייניים בין הצלחות של כמויות שווה של 30 ± 0.5 מיליליטר של LB אגר. הבדל (ב &#39;) בין תנאי גובה שונים: הפצת המראה נמדד לצלחות עם כרכים של 20 ± 0.5 מיליליטר (אדום), של 30 ± 0.5 מיליליטר (ירוק) ושל 40 ± 0.5 מיליליטר (כחול). כל תנאי הוא הממוצע של 6 צלחות שונות. כל עוד את עוצמת הקול של הצלחות היא בתוך הטווח ± 5 מיליליטר, האטימות היא דומות ומובילה להפצה דומה בזמן הופעה.

Watch this Scientific Journal Video about ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time at JoVE.com

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Video: ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול"ג בזמן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video