We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. Erstellen Sie das Setup- <ol><li> Wählen Sie einen Flachbettscanner mit einer optischen Auflösung: 4.800 dpi; Hardware-Auflösung: 4.800 x 9.600 dpi; Farbtiefe: 48 bit, die an den jeweiligen Temperatur und Luftfeuchtigkeit arbeiten können. </li><li> Petrischalen haben erhebliche Lautstärke, im Gegensatz zu Papier in der Regel auf kommerziellen Scannern. Die Kolonien liegen auf der Oberseite des Agar-Schicht, ungefähr 5 mm über der Scanneroberfläche. Hinweis: Für die meisten Scanner die Kolonien werden fokussiert. </li><li> Einige Scanner-Unternehmen nicht erlauben den Anschluss von mehr als einer Instanz der Scanner des gleichen Typs auf dem gleichen Computer. Stellen Sie sicher, dass mehr als ein Scanner angeschlossen und eindeutig identifiziert werden. </li><li> Bereiten Sie das Zubehör, wie unten aufgeführt: <ol><li> Bereiten Stücke von schwarzem Filz sterile Tuch, um die Platten bedeckt sind (Abbildung 1 Schritt 2). </li><li> Um die Petrischalen in Position zu halten, bereiten weißen Plattenhalter (Materialien und Methoden), die die Scanner, die passen und 6 hol habenn die Größe der Schalen (1 Schritt 3). </li></ol></li><li> Wenn die für das Wachstum des Mikroorganismus benötigt werden, stellen die Scanner in einer temperaturgeregelten Umgebung. Verbinden der Scanner an den Computer. </li><li> Optional: Verbinden Sie das Relais an den Computer an und umgehen die Ein / Aus-Schalter des Scanners, um Temperaturgefälle zu überwinden. HINWEIS: Die Relaiseinheit ist für extrem temperaturempfindlichen Mikroorganismen. Sie schaltet den Scanner so, dass die Elektronik nicht die Oberfläche ungleichmäßig erhitzen. Mit nur einem Teil der Oberfläche des Scanners können ähnliche Ergebnisse zu erzielen. </li></ol> 2. Installieren des Scan-Managers <ol><li> Kopieren Sie alle &quot;Scan-Manager&quot; Anwendungsdateien in einem bestimmten Verzeichnis aus http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Konfigurieren ScanningManager.exe.config Datei entsprechend den Scanner Namen, in der Computerverwaltung-&gt; Geräte-Manager-&gt; Imaging Devices (erscheint <strong&gt; Abbildung 2). </li><li> Für die Fehlersuche der &quot;Scanning-Manager&quot;-Anwendung finden Sie in der Readme-Datei. </li><li> Für weitere Dokumentation auf der &quot;Scanning-Manager&quot;-Anwendung finden Sie Documentation.html. </li></ol> 3. Führen Sie ein Experiment <ol><li> Bereiten Sie die Petrischalen (Abbildung 1): <ol><li> Verdünnte die Kultur etwa 2.000 CFU / ml. Platte 0,1 ml Kultur gleichmäßig auf der Plattenoberfläche. </li><li> Um einen guten Kontrast zwischen den Kolonien und die Schale zu gewinnen und Feuchtigkeit wird die Platte mit einem Stück schwarzen Filz sterilen Tuch. Setzen Sie Deckel auf der Platte. </li></ol></li><li> Platzieren der Platten in den Halterungen an den Scanner. </li><li> Starten Sie den Scan-Manager (Abbildung 3): Wählen Sie die teilnehmenden Scanner aus der Liste der angeschlossenen Scanner. Wählen Sie die Anzahl der Bilder, die (Wiederholungen) entnommen werden, das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Bildern (Zeitlücke) und die Zeitverzögerung, bevor ter experimentieren (Start nach). </li></ol> 4. Analyse der Bilder HINWEIS: Eine Übersicht über Berechnungsmethoden für die Analyse der Bilder in MATLAB mit &quot;ScanLag&quot;, die frei verfügbar für nicht-kommerzielle Nutzung an http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications ist vorgesehen. html. Weitere Funktionen sind in der Software-Handbuch beschrieben und ein Beispiel-Code ergänzt. <ol><li> Die Bilder von jedem Scanner Sortierung in separaten Ordnern. </li><li> Mit Befehlsfenster Matlab, führen Sie die folgenden Verfahren. Die um diese Verfahren ausführen Parameter werden im Software-Handbuch definiert. <ol><li> Führen PreparePictures Vorverarbeitung durchführen: In der Vorverarbeitung werden die Bilder von einem Scanner ausgerichtet ist. Jede Petrischale wird aus jeder Folge von Bildern abgeschnitten. Der Zeitpunkt, zu dem jedes Bild gesammelt wurde, wird von der Zeitstempel abgerufen. </li><li> Führen TLAllPlates zu Erkennung und Verfolgung durchzuführen In Each Petrischale getrennt, Kolonien werden erkannt und eine Identifikationsnummer zugewiesen. </li><li> Analyse der extrahierten Daten: Die Größen der einzelnen Kolonie erkannt werden als eine Funktion der Zeit gemessen. Um das Erscheinungsbild Verteilung der Kolonien zu extrahieren verwenden Sie die folgenden Funktionen in Matlab-Befehlsfenster (weitere Informationen finden Sie im Software-Handbuch vorhanden): <ol><li> Führen ScanLagApp, um die Analyse eines bestimmten Petrischale zusammen mit dem Graphen der Kolonien Display-Größe über der Zeit (Abbildung 4). <ol><li> Verwenden Sie den Schieberegler, um die aktuelle Zeit von der Platte zu ändern. Der Zeitpunkt wird auch durch eine entsprechende vertikale Linie auf der Kolonien Flächendiagramm angezeigt werden. </li><li> Klicken Sie auf eine Kolonie zu seinem zugehörigen Kurve zu sehen, und umgekehrt, klicken Sie auf eine Kurve zu seinem zugehörigen Kolonie zu finden. Nach der Identifizierung der Kolonie kann der Phänotyp, der durch die Auswahl der Kolonie von der Petrischale identifiziert abgerufen werden. </li><li> Filter Fehler in der automatischen Analyse von choosingen eine Kolonie und dann auf die Schaltfläche auszuschließen. Beim Anklicken ausschließen die Anzahl der Kolonie wird gelb. </li></ol></li><li> Nachdem man durch die Ergebnisse der Analyse von jeder Platte, fassen die Ergebnisse: <ol><li> Führen AddHistograms um ein Histogramm der Erscheinungszeiten erstellen. </li><li> Führen plotDeathCurve um eine Überlebenskurve Darstellung der Verteilung erstellen. </li><li> Führen GetAppearanceTimes, um das Aussehen Zeit aller Kolonien im Experiment zu bekommen. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phenotypic+characterization+of+bacteria.">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li><li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Nature+of+Bacterial+Lag.">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria,+with+special+reference+to+continuous+culture.">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li><li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis.">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li><li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies.">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes.">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li><li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics.">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li><li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis.">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li><li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations,+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells.">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li><li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age.">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner.">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mikroskopische Methoden, die auf die direkte Beobachtung werden oft als die &quot;goldene Standard&quot; für das Studium Single-Cell-Verhalten betrachtet. ScanLag, die Messung der Verteilung der Verzögerungszeiten in Bakterienpopulationen ermöglicht, liefert Daten in guter Übereinstimmung mit der von der Einzelzellanalyse erhaltene Verteilung und erzielt viel höhere Statistik. Mehrere wichtige Schritte müssen für diese Methode durchgeführt werden, um gut zu funktionieren: Erstens, nicht auf die Scanner-Auflösung, die 4800 x 9600 sein sollte, um gute Bilder zu erhalten gefährden. Zweitens, bewusst sein, dass es ohne die Power-Management-Modul (Schritt 1.6), Temperaturgefälle auf der Flachbett-Oberfläche entwickeln und das Wachstum beeinflussen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Filtration von Defekten wie z. B. Staub, die fälschlicherweise als Kolonien, die von der Software gezählt haben kann. Der integrierte Hintergrundabzug der Software überwindet diese Mängel in der Regel, aber manchmal &quot;false&quot; Kolonien müssenmanuell gefiltert werden. Die wichtigsten Schritte zur Problembehandlung zwischen den Platten Variation Adresse könnte in die Einrichtung, aus mehreren Gründen: (a) Die Wachstumsrate der Mikroorganismen wird durch die Temperatur beeinflusst. Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen aufgrund der ungleichmäßigen Belüftung oder Position der Schale im Inkubator erfolgen. (B) Die Elektronik der Scanner könnte erwärmen und zu einem Temperaturgradienten über die Oberfläche des Scanners. Fig. 10 zeigt den Einfluß eines solchen räumlichen Wärmegradienten über Bacillus Bakterien zusammen mit den Messungen der Temperatur auf der Oberfläche vor dem Scanner und nach der Implementierung des Power-Management-Modul (Schritt 1.6). Beachten Sie, dass dieses Modul vielleicht nicht für neuere Scanner notwendig sein, und wenn nur ein Teil der Scanner-Oberfläche verwendet wird, kann die Energieverwaltung unnötig. (C) Platten mit unterschiedlicher Opazität des Nährstoff-Agar könnte, um verschiedene Ebenen der Erkennung führen. Fig. 11 thE Toleranz für unterschiedliche Volumina Nähragar, die in verschiedenen Trübungen führen. Experimentell ScanLag die Technik ist einfach durchzuführen und erfordert nur Mikroorganismen auf Standard-Petrischalen Platte, und sie auf die Scanner-Oberfläche platzieren. Die, die entwickelt wurde Software steuert den gesamten Vorgang. Die Bildaufnahme wird automatisch durchgeführt, und die Bildanalyse zur Kolonieverfolgung ist auch automatisch. Weiterhin kann das System vergrösserte werden, um viele verschiedene Bedingungen zur gleichen Zeit zu messen. Schließlich beruft sich die Methode für kommerzielle Büroscanner und ist daher kostengünstig. Diese Technik kann zur Erforschung von Mikroorganismen, die aus E. unterscheiden verlängert coli K-12, jedoch einige Überlegungen müssen gemacht werden. Erstens muss der Einfluss des frühen erscheinen Kolonien auf den späteren bewertet werden, wie im einzelnen in einer früheren Veröffentlichung 7 beschrieben. Für E. Coli K-12, diemaximale Dichte von KBE pro Platte beträgt 200. Andere Stämme mit verschiedenen Größen der Kolonien, und andere mögliche Übersprechen zwischen Kolonien, könnte eine andere Dichte erfordern. Zweitens wird die Analyse der Platten auf bestimmte Software-basierte Schwellenwerte, müssen möglicherweise modifiziert werden, abhängig von dem Kontrast zwischen dem festen Medium und die Kolonien kalibriert. Die Software kann auch erweitert werden, um andere Kolonie Merkmale zu extrahieren, über Verzögerung und Wachstumsrate. Der Software-Code ist offen und kann modifiziert werden, um Kolonie Form, Helligkeit, Glätte und Farbe zu extrahieren. Da Messungen an Kolonien, die aus einzelnen Zellen stammen vorgenommen, die Daten zeigen neue Phänotypen, die nicht durch Bevölkerungsebene Messungen gemessen werden kann. Die Bedeutung der Verzögerungszeitverteilung wird in Gegenwart von Antibiotika offenbart. Viele Antibiotika sind dafür bekannt, effektiv zu sein nur gegen wachsende Zellen; daher so lange wie Zellen bleiben in der Lag-Phase und nicht wachsen, sind sie provon Auswirkungen dieser Antibiotika 21 geschützt. Wenn die Zahl der Überlebenden Bakterien werden in Zeitintervallen während der Behandlung mit Antibiotika 15,22,23 ausgewertet wird eine Subpopulation von Bakterien, genannt persisters oft offenbart. In bestimmten Fällen Immunität gegen Antibiotika-Behandlung stammt aus längeren Verzögerung. Mit diesem Aufbau ist diese Verzögerung ergeben, und oft eine nicht-triviale Verteilung 24 (Fig. 6). Dieses Verfahren ermöglicht auch die Wiedergewinnung von seltenen Mutanten. Beispielsweise nach der Plattierung einen mutagenisierten Population, Mutanten können basierend auf den Phänotyp identifiziert und isoliert werden direkt, ohne Selektion. Die Einrichtung könnte auch Zell-Zell-Interaktionen zu überwachen durch Messung des Wachstums der Kolonien in Abhängigkeit von der Dichte benachbarter Kolonien und Phänomene wie Quorum Sensing oder die Ausbreitung von Bakterien zu quantifizieren Schwärmen. Mehrdimensionale Informationen, die von zukünftigen Experimenten mit dieser Methode aufgedeckt werden, um eine bessere Charakterisierung der mikrobiellen Population führens und der Fortschritte in der Medizin-und Umweltforschung.

Bakterien entwickelt haben, um zu vielen stressigen Bedingungen zu reagieren. Ein allgemeines Merkmal der Anpassung an Stress ist eine Änderung der Wachstumsdynamik 1,2. Die exponentielle Wachstumsrate und die Verzögerungszeit, nämlich die Zeit benötigt, um an neue Bedingungen anzupassen: Wachstumsdynamik wird meist durch zwei Parameter gekennzeichnet. Wohingegen eine große Anzahl von Hochdurchsatz-Methoden konzentrieren sich auf Messungen der Wachstumsrate, die Verzögerungszeit oft eine übersehene Parameter, obwohl es der entscheidende Parameter für die Charakterisierung der Anpassung an neue Bedingungen. Die Quantifizierung der Anpassung an sich verändernde Bedingungen durchgeführt worden ist traditionell mit mühsamen manuellen Methoden 3,4. Kürzlich wurden fortgeschrittene Techniken zur Analyse von Einzelzellen 5,6 entwickelt. Jedoch ist es immer noch schwierig, ein normales Wachstum zu unterscheiden nach einer Verzögerung des Wachstums (nämlich eine Verzögerungszeit) von 2,3 langsames Wachstum. Automatisiertes Verfahren wurde konstruiert, ScanLag 7, umzu unterscheiden zwischen diesen beiden ähnliche Phänotypen. Ein markantes Beispiel für die Bedeutung der Studie der Verzögerungszeit Verteilung unter Antibiotika-Behandlung enthüllt. Viele Antibiotika und anderen Belastungen zu töten nur aktiv wachsenden Zellen, und somit Zellen, die &quot;rückständigen&quot; sind geschützt 8. Um Verzögerungszeit zu überwachen, kann man einzelne Zellen unter dem Mikroskop beobachten und überwachen die erste Liga Zeit. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist, dass die dynamische Zeitbereich ist begrenzt; diejenigen Zellen, die früh wachsen bedecken die Oberfläche mit einer exponentiellen Rate, effektiv abnehm das Wachstum von Zellen mit längeren Verzögerungszeit. Verwendung von Strömungskammern etwas umgeht dieses 5, aber eine begrenzte Anzahl von Zellen verfolgt werden kann und der Anteil der Bakterien, die die Lag-Phase verlassen, nachdem die Mehrheit der Bevölkerung hat begonnen wächst nicht beobachtet werden kann. Trotz dieser Einschränkungen sind einige Studien des Einflusses der Gehalt an Di ausgewertetfferent betont auf Zeitverzögerung der Verbreitung mittels Einzelzellmikroskopie 12.09. Eine weitere Möglichkeit, Verzögerungszeit Verteilung zu überwachen, ist durch Trübungsmessungen 13,14. Viele parallele Kulturen, jeweils gestartet von einer einzelnen Zelle, in einem optischen Lesedichte, die die Anzahl von Bakterien in der Kultur im Laufe der Zeit misst gewachsen. Dieses Verfahren ist durch die Genauigkeit der Extrapolation und der Anzahl der Vertiefungen in einer Platte beschränkt. Ein automatisiertes Verfahren entwickelt, genannt ScanLag, dass Verzögerungszeiten und Wachstumszeitverteilungen ermöglicht zu beurteilen, auch für den kleinen Prozentsatz von Bakterien in einer Population, die sehr lange Verzögerungszeiten haben. Das Verfahren basiert auf dem Nachweis von Kolonien auf Nähragar herkömmlichen Platten 15 (Fig. 1) auf. Um automatisieren Erkennung 16,17 eine Reihe von kommerziellen Scanner 18, die von Software im Haus gerichtet sind, in regelmäßigen Abständen Bilder der Platten zu erwerben, wurde entwickelt. Software warentwickelt, um die Bilder automatisch zu analysieren und zu extrahieren 19,20 quantitative Parameter wie Zeit des Erscheinens der jeweiligen Kolonie und Wachstumszeit jeder Kolonie, die hier definiert als die Zeit, um von 20 Pixel auf 80 Pixel wachsen. Hier stellen wir die Methode im Detail, einschließlich der Konfiguration des Systems und die Verwendung der automatisierten Bildanalyse-Software, die eine bessere Benutzerschnittstelle verbessert ist. Dieses Verfahren geeignet ist, andere Eigenschaften der Kolonien, wie Morphologie und Farbe zu messen. Die Messung dieser Arten von Parametern wird die Verwendung des Systems in mehrdimensionalen Phenomics ermöglichen. Da das Verfahren erkennt Kolonien aus Einzelzellen, kann das System neue Phänotypen, die nicht durch Bevölkerungsebene Messungen gemessen werden kann offenbaren. Die Technik ermöglicht die Erfassung und Wiedergewinnung von seltenen Varianten und erleichtert Screening nach gewünschten Merkmalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Als ein Beispiel der Verzögerungszeit Verteilungsextraktions, Fig. 5 zeigt die Fähigkeit von ScanLag mit spezifischen Eigenschaften auf eine Platte über die Zeit zu identifizieren und zu verfolgen jede Kolonie, wie sie in einem Screening-Assay durchgeführt werden. Wenn die Kultur des Mikroorganismus ist heterogen, könnten die verschiedenen Subpopulationen sich während des Assays zeigen. Zum Beispiel zeigt Fig. 6 die Darstellung Quantifizierung und somit zeigt bimodale Verzögerungszeitverteilung in einem Mutantenstamm von E. coli. Die Wachstumsrate der Zellen beeinflusst die Auftrittszeit der Kolonie. Wenn Kolonien wachsen mit der gleichen Geschwindigkeit kann der späte Auftreten zu der Verzögerungszeit (Fig. 7) zurückgeführt werden. Um zu überprüfen, dass die Methode tatsächlich misst die Verzögerungszeit von Einzelzellen verglichen wir ScanLag Ergebnisse mit den Ergebnissen Einzelzellmikroskopie; ist diese Prüfung abausführlich in einer früheren Publikation 7 ribed. Dieses Verfahren ermöglicht die Überwachung von viel mehr Zellen als mit Mikroskopie ausgewertet. Die Verwendung von Mikroskopie und mit ScanLag erhaltenen Ausschüttungen weitgehend überlappen. Die ScanLag Verteilung ist etwas breiter; theoretische Analysen vorhersagen Erweiterung in der Größenordnung der Standardabweichung der Teilung Zeit. Wenn Wachstumszeit ist für jeden Stamm, muß der Ursprung der Verzögerung in der Erscheinung weiter untersucht werden, die mit anderen Verfahren. Der Einfluss des frühen erscheinende Kolonien auf das Aussehen der Kolonien wurde später untersucht. Kontrollexperimente 7 bestätigt, dass spätere Aussehen so lange wie die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte hat (Abbildung 8) nicht mehr als 200 nicht betroffen war. Ein weiteres Kontrollexperiment bestätigt, dass der Standort der Kolonie auf der Platte wurde sein Aussehen Zeit 7 nicht zu beeinträchtigen. Die Analyse des pneuste wird spezifischen Schwellenwerten, die eine Modifizierung in Abhängigkeit von Nährstoffen in Wachstumsmedium oder dem Typ des Mikroorganismus vorliegt benötigen kalibriert. Dennoch ist die Analyse für eine Vielzahl von Schwellenwerten ziemlich robust wie in Fig. 9 gezeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Eine schematische Darstellung der Schritte, um eine Kolonie Aussehen Verteilung erstellen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Ein Screenshot der Geräte-Manager zeigt die Namen der angeschlossenen Scanner und der Konfigurationsdatei. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern</a>Version dieser Figur. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Ein Screenshot der Scan Manager Abbildung 3.. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Ein Screenshot der ScanLagApp. Ein Bild der Platte ist auf der linken Seite, und die Wachstumskurven der einzelnen Kolonie sind auf der rechten Seite, wie in der Anleitung beschrieben. Die Spitzen in einigen Kolonien Bereich Kurven auftreten, wenn zwei oder mehr Kolonien zu verschmelzen. Beim Zusammenführen der Kolonien erfolgt, wird der Bereich dieser Kolonien als gemeinsames Gebiet betrachtet. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> 5. Ein repräsentatives Ergebnis der Analyse einer Platte. (A) Ein Bild von dem Ausgang der Erfassungsanwendung am Ende des Experiments. Jede Kolonie Bereich identifiziert wird, gefärbt und mit einer eindeutigen ID-Nummer zugewiesen. Die Pfeile zeigen auf repräsentative Kolonien in B. gemessen Die Kolonie wird auf der Grundlage Intensitätsschwelle erkannt (für E. coli-Kolonien auf LB-Agar-Agar oder M9 diese Schwelle beträgt 0,03. Für andere Medien oder Bakterien, diese Schwelle in den Funktions ProcessPictures eingestellt werden ). Nur Objekte über 10 Pixel gezählt (diese Schwelle in den Funktions MatchColonies geändert werden). Nachweis einer Kolonie beginnt bei etwa 10 5 Bakterien. (B) Grundstücke der Fläche in Pixeln gegenüber der Zeit von vier repräsentativen Kolonien in dieser Platte. Das &quot;Aussehen Zeit&quot; jeder Kolonie ist, wenn die Kolonie festgestellt wird. Die &quot;Wachstumszeit&quot; jeder Kolonie wird hier definiert als die Zeit, her wachsenm 20 Pixel auf 80 Pixel (diese Grenzen einstellbar mit der Funktion getAppearanceGrowthByVec sind). Die Software schließt die Kolonien, die vor dem Erreichen der oberen Grenze zusammengeführt. Identifizierung einer besonderen Kolonie nach seiner Eigenschaften ist einfach dank der Identifikationsnummer und die Farbe zu jeder Kolonie zugeordnet. Beispiels Kolonien # 1, 56, 77 und 124 sind in beiden Graphen hervorgehoben. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Aussehen Quantifizierung Abbildung 6. Können bimodale Verteilung Verzögerungszeit offenbaren. Vergleich ScanLag Analyse Histogramme der Auftritt mal für zwei verschiedene Stämme. Blaue Linie: Wildtyp-Stamm wächst exponentiell (Gesamt: 1.320 Kolonien); rote Linie hohe Persistenz-Mutante mit hinkt Bakterien (Gesamt: 1.529 Kolonien) bereichert. (A) Normierte Histogramme Aussehen. Der Spitzendes Auftretens von exponentiell wachsenden Zellen ist die typische Zeit, um eine nachweisbare Kolonie wachsen. Einschub: gleiche Histogramm des Mutantenstammes nach Abzug der Zeitpunkt der Spitze der exponentiellen Kultur, um die tatsächliche Zeitverzögerung auf Log beabstandeten Fächern, die die Verzögerungszeit bimodale Verteilung zu erhalten. (B) Überlebensfunktion von den gleichen Daten wie in (A) auf einer logarithmischen Skala. Diese Darstellung verbessert die späte Auftreten Schwanz der Mutante. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Aussehen Verteilung und Wachstum Zeitverteilung. (A) und (B) zeigen zweidimensionale Histogramm der Auftrittszeit und die Wachstumszeit der zwei unterschiedlichen Bedingungen (Die Software schließt Kolonien, die vor dem Erreichen der oberen Grenze zusammengeführt). (C) Vergleichen der Histogrammeder beiden Stämme zeigen den Unterschied im Aussehen der Zeit, während die Wachstumszeiten (D) ähnlich sind. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8. Das Aussehen der frühen Kolonien nicht mit dem Aussehen des späteren Kolonien stören. (A) lag time Verteilung von Wildtyp-Zellen allein plattiert. (B) zurückbleiben Zeitverteilung eines kalten sensiblen Stamm allein, nach der Übertragung auf permissiven Temperatur. (C) zurückbleiben Zeitverteilung beider Stämme unter den gleichen Bedingungen zusammen plattiert. Die schwarze Linie stellt die erwartete Verteilung auf der Grundlage der Messung erhalten wird, wenn jeder Stamm separat Daten. Ein gut eingreement zwischen erwarteten und gemessenen Verteilungen ist, solange die Gesamtzahl der Kolonien pro Platte unter 200 erhalten. <img alt="Fig. 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. 9 der Detektionsschwelle beeinträchtigt nicht die Form der Kolonie Aussehen Verteilung Die Kolonie Aussehen Verteilung wurde für den gleichen Datensatz mit zwei verschiedenen Schwellengrößen analysiert; (A) Schwellengröße ist 10 Pixel; (B) Schwellengröße ist 50 Pixel. Anzahl der Zellen pro Histogramm: ca. 1500. Die unterschiedlichen Detektionsschwelle nur zu einer Verschiebung der Erfassungszeit. <img alt="10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Abbildung 10. Temperaturstabilität Messungen across die Scanner-Oberfläche. (A) Bild von einer Platte mit Kolonien von Bacillus subtilis auf den Scanner ohne Power Management gewachsen. Die Oberfläche ist wärmer auf der Unterseite und damit die Kolonien wachsen schneller. Die schrittweise Linie neben der Platte ist eine schematische Darstellung der Wärmegefälle. (B) Die Temperaturstabilität wurde mit zwei Thermoelemente über die Scanner-Oberfläche platziert gemessen. Der Scanner erwärmt sich während jeder Abtastung und über die Zeit. (C) Mit Power Management ist die Temperatur gleichmäßiger und die Kolonien wachsen mit ähnlichen Raten. (D) wie (B) mit dem Power-Management-Modul. Temperaturkonstanz von ± 0.2 ° C. <img alt="11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Abbildung 11. Unterschiede in der Erscheinung Verteilung kann durch di seinfferences in den Bänden von Festmedium. Das gleiche Bakterienkultur wurde auf Platten mit unterschiedlichen Volumina LB-Agar ausplattiert, was zu einer unterschiedlichen Höhe der Agaroberfläche. Die unterschiedlichen Höhen führte zu unterschiedlichen Opazität der Platten und damit eine andere Detektionszeit. Die Zwischenplatten Unterschied wurde geprüft, und die Differenz zwischen den verschiedenen Höhenbedingungen. (A) Typische Unterschiede zwischen den Platten gleicher Volumina von 30 ± 0,5 ml LB-Agar. (B) Unterschied zwischen den verschiedenen Höhenbedingungen: das Aussehen Verteilung für Platten mit einem Volumen von 20 ± 0,5 ml (rot) von 30 ± 0,5 ml (grün) und 40 ± 0,5 ml (blau) gemessen. Jede Bedingung ist der Durchschnitt von 6 verschiedenen Platten. Solange das Volumen der Platten innerhalb von ± 5 ml-Bereich, ist die Deckkraft ähnlich und führt ähnliche Erscheinung Zeitverteilung.

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Serie: ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...