We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. بناء الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ماسحة مسطحة مع قرار بصري: 4،800 نقطة في البوصة؛ قرار الأجهزة: 4،800 خ 9،600 نقطة في البوصة؛ لون عمق بت: 48 بت، التي يمكن أن تعمل في درجات الحرارة والرطوبة ذات الصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق بتري لديها حجم كبير، على عكس ورقة تستخدم عادة في الماسحات الضوئية التجارية. المستعمرات تقع على الجزء العلوي من طبقة أجار، حوالي 5 مم فوق سطح الماسح الضوئي. ملاحظة: بالنسبة لمعظم الماسحات الضوئية المستعمرات ستكون في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض الشركات لا تسمح الماسح الضوئي ربط أكثر من مثيل واحد من الماسح الضوئي من نفس النوع لنفس الكمبيوتر. تأكد من أن الماسح الضوئي أكثر من واحد يمكن تركيبها وتحديدها بشكل فريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الملحقات كما هو مفصل أدناه: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شعرت إعداد قطعة من القماش الأسود عقيمة لتغطية لوحات (الشكل 1 الخطوة 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعقد أطباق بتري في مكان، وإعداد أصحاب وحة بيضاء (المواد والأساليب) التي تتلاءم مع الماسحات الضوئية والتي لديها 6 الحولوفاق حجم الأطباق (الشكل 1 الخطوة 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر لنمو الكائنات الحية الدقيقة، ووضع الماسحات الضوئية في بيئة درجة الحرارة التي تسيطر عليها. توصيل الماسحات الضوئية إلى الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: قم بتوصيل التتابع إلى الكمبيوتر وتجاوز على / قبالة التحول من الماسح الضوئي للتغلب على درجة الحرارة التدرج. ملاحظة: وحدة التتابع هو غاية لدرجة الحرارة الحساسة الكائنات الحية الدقيقة. أنها تطفئ الماسح الضوئي بحيث الالكترونيات لا تسخن سطح غير متساو. استخدام سوى جزء من سطح الماسح الضوئي قد يحقق نتائج مماثلة. </li></ol> 2. تثبيت مدير الضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ كافة ملفات التطبيق &quot;مدير الضوئي &#39;إلى دليل معين من http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين ملف ScanningManager.exe.config وفقا لأسماء الماسحات الضوئية كما تظهر في إدارة الكمبيوتر&gt; إدارة الأجهزة&gt; أجهزة تصوير ( <stroنانوغرام&gt; الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستكشاف تطبيق &quot;مدير الضوئي&quot;، راجع قراءة لي الملف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من المعلومات حول تطبيق &quot;مدير الضوئي&quot;، انظر Documentation.html. </li></ol> 3. قم بإجراء التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق بتري (الشكل 1): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة إلى ما يقرب من 2،000 كفو / مل. لوحة 0.1 مل من ثقافة موحدة على سطح اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على النقيض جيدة بين المستعمرات والطبق وامتصاص الرطوبة، وتغطي لوحة بقطعة من القماش الأسود العقيمة شعر. وضع غطاء على طبق من ذهب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات في حملة على الماسحات الضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل إدارة الضوئي (الشكل 3): اختيار الماسحات الضوئية المشاركة من قائمة الماسحات الضوئية المرفقة. اختيار عدد من الصور التي يتعين اتخاذها (التكرار)، الفاصل الزمني بين الصور اللاحقة (الفجوة الزمنية)، وتأخير الوقت قبل البدء رانه تجربة (ابدأ بعد). </li></ol> 4. تحليل الصور ملاحظة: يتم توفير الخطوط العريضة للطرق الحسابية لتحليل الصور في MATLAB باستخدام &quot;ScanLag&quot;، وهو متاح مجانا للاستخدام غير التجاري في http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. أتش تي أم أل. وترد تفاصيل وظائف أخرى متاحة في دليل البرنامج، وتستكمل رمز المثال. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز الصور من الماسح الضوئي كل في مجلدات منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إطار الأوامر ماتلاب، وتشغيل الإجراءات التالية. يتم تعريف المعلمات المطلوبة لتشغيل هذه الإجراءات في دليل البرنامج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل PreparePictures لأداء تجهيزها: في تجهيزها، يتم محاذاة الصور من الماسح الضوئي. يتم اقتصاص كل طبق بتري من كل سلسلة من الصور. يتم استرداد الوقت الذي تم جمع كل صورة من الطابع الزمني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TLAllPlates تشغيل لأداء الكشف والتتبع في البريدطبق بيتري منفصل منظمة العمل ضد الجوع، تم الكشف عن المستعمرات وتعيين رقم تعريف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم قياس أحجام من كل مستعمرة الكشف عن وظيفة من الزمن: تحليل البيانات المستخرجة. لاستخراج توزيع ظهور المستعمرات استخدام وظائف التالية في إطار الأوامر مطلب و(مزيد من المعلومات متاحة في دليل البرامج): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل ScanLagApp لعرض تحليل طبق بتري معينة إلى جانب مع الرسم البياني للحجم المستعمرات مقابل الوقت (الشكل 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم المنزلق لتغيير الوقت الحالي من لوحة. كما سيتم أشار توقيت بواسطة خط عمودي مطابقة على الرسم البياني منطقة المستعمرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على مستعمرة لرؤية منحنى المرتبط به، والعكس بالعكس، انقر على منحنى للعثور على مستعمرة المرتبط به. بعد تحديد المستعمرة، والنمط الظاهري يمكن استرجاعها عن طريق التقاط مستعمرة من طبق بيتري التي تم تحديدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيوب مرشح في التحليل التلقائي بواسطة تشوالغناء مستعمرة والنقر على زر استبعادها. وعند النقر على استبعاد عدد من مستعمرة تتحول الصفراء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يمر على نتائج تحليل كل لوحة، وتلخيص النتائج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل AddHistograms لإنشاء مدرج تكراري مرات المظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل plotDeathCurve لإنشاء تمثيل منحنى البقاء للتوزيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل GetAppearanceTimes للحصول على وقت ظهور جميع المستعمرات في التجربة. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phenotypic+characterization+of+bacteria.">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li><li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Nature+of+Bacterial+Lag.">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria,+with+special+reference+to+continuous+culture.">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li><li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis.">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li><li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies.">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes.">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li><li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics.">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li><li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis.">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li><li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations,+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells.">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li><li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age.">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner.">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وغالبا ما ينظر إلى الأساليب المجهرية يعتمد على الملاحظة المباشرة ب &quot;معيار ذهبي&quot; لدراسة السلوك وحيدة الخلية. يوفر ScanLag، والتي تمكن من قياس توزيع مرات تأخر في السكان البكتيرية والبيانات في اتفاق جيد مع التوزيع تم الحصول عليها من تحليل وحيدة الخلية ويحقق الإحصاءات أعلى من ذلك بكثير. العديد من الخطوات الحاسمة يجب أن تؤديها لهذا الأسلوب للعمل بشكل جيد: أولا، لا نساوم على القرار الماسح الضوئي، الذي ينبغي أن يكون 4،800 9،600 س للحصول على صور جيدة. الثاني، أن ندرك أنه بدون وحدة إدارة الطاقة (الخطوة 1.6)، ودرجة الحرارة التدرج قد وضع على سطح مسطحة وتؤثر على النمو. خطوة هامة أخرى هو الترشيح من العيوب مثل الغبار التي قد تم فرزها عن طريق الخطأ كما المستعمرات من قبل البرنامج. الطرح خلفية المدمج في البرنامج عادة ما يتغلب على هذه العيوب، ولكن لديها المستعمرات أحيانا &quot;كاذبة&quot; لتتم تصفيته يدويا. الخطوات الرئيسية استكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تعالج بين لوحة التباين في الإعداد، ويرجع ذلك إلى عدة أسباب: (أ) ويتأثر معدل نمو الكائنات الدقيقة في درجة الحرارة. يمكن أن تحدث درجة الحرارة والرطوبة ظروف مختلفة بسبب التهوية غير المستوية أو موقع الطبق في الحاضنة. (ب) والالكترونيات من الماسح الضوئي قد تسخن وتسبب التدرج في درجة الحرارة عبر سطح الماسح الضوئي. الشكل 10 يظهر تأثير هذا الانحدار الحرارة على البكتيريا العصوية المكانية، جنبا إلى جنب مع قياسات لدرجة الحرارة على سطح الماسح الضوئي قبل و بعد تنفيذ وحدة إدارة الطاقة (الخطوة 1.6). لاحظ أن هذه الوحدة قد لا يكون ضروريا لأحدث الماسحات الضوئية، وإذا تم استخدام سوى جزء من سطح الماسح الضوئي، قد تكون إدارة الطاقة لا لزوم لها. (ج) لوحات مع التعتيم مختلفة من المغذيات أجار قد تؤدي إلى مستويات مختلفة من الكشف. الشكل 11 يظهر اله التسامح لأحجام مختلفة من المغذيات آجار التي تؤدي إلى عتامة مختلفة. تجريبيا تقنية ScanLag من السهل لتنفيذ ويتطلب فقط لوحة الكائنات الحية الدقيقة على أطباق بتري القياسية، ووضعها على سطح الماسح الضوئي. البرنامج الذي تم تطويره تسيطر على الإجراء بأكمله. ويتم الحصول على الصور تلقائيا، وتحليل الصور لتتبع المستعمرة هو أيضا التلقائي. وعلاوة على ذلك، فإن النظام يمكن زيادتها المتابعة لقياس ظروف عديدة ومختلفة في نفس الوقت. أخيرا، تعتمد الطريقة على الماسحات الضوئية المكاتب التجارية، وبالتالي، هو التكلفة المنخفضة. ويمكن تمديد هذه التقنية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة والتي تختلف من E. القولونية K-12، ولكن عدة اعتبارات يجب أن تتم. الأولى، وتأثير المستعمرات التي تظهر في وقت مبكر على تلك في وقت لاحق لابد من تقييمها، كما هو موضح بالتفصيل في نشرة سابقة 7. لE. القولونية K-12، والكثافة القصوى من كفو لكل لوحة 200. سلالات أخرى ذات أحجام مختلفة من المستعمرات، وغيرها عبر الحديث محتملة بين المستعمرات، قد تتطلب كثافة مختلفة. الثاني، هو معايرة تحليل لوحات عتبات البرمجيات القائمة المحددة التي قد تحتاج إلى تعديل، اعتمادا على التناقض بين المتوسطة الصلبة والمستعمرات. ويمكن تمديد البرنامج أيضا لاستخراج الخصائص مستعمرة أخرى، وراء تأخر ومعدل النمو. رمز البرمجيات مفتوحة ويمكن تعديلها لاستخراج شكل مستعمرة، والسطوع، نعومة ولون. لأنه يتم إجراء القياسات على المستعمرات التي تنشأ من الخلايا واحدة، تكشف البيانات الظواهر الجديدة التي لا يمكن قياسها بواسطة القياسات على مستوى السكان. وكشفت أهمية توزيع الوقت الضائع في وجود المضادات الحيوية. ومن المعروف أن العديد من المضادات الحيوية تكون فعالة فقط ضد الخلايا المتنامية؛ ولطالما بقيت الخلايا في مرحلة متخلفة والتي لا تنمو، فهي المواليةtected من آثار تلك المضادات الحيوية 21. عندما يتم تقييم أعداد البكتيريا الناجين في فترات زمنية أثناء العلاج بالمضادات الحيوية 15،22،23، وغالبا ما يتم كشف جزء من السكان من البكتيريا، ودعا صوامد،. في بعض الحالات، والحصانة للعلاج بالمضادات الحيوية تنبع من تأخر لفترة طويلة. باستخدام هذا الإعداد، تبين هذا التأخر، ولها توزيع غير تافهة 24 (الشكل 6) في كثير من الأحيان. هذه الطريقة تمكن أيضا استرجاع المسوخ نادرة. على سبيل المثال، بعد الطلاء السكان mutagenized، يمكن تحديد المسوخ على أساس النمط الظاهري ومعزولة مباشرة، دون التحديد. يمكن أن الإعداد أيضا رصد التفاعلات خلية خلية عن طريق قياس نمو المستعمرات بوصفها وظيفة من كثافة المستعمرات المجاورة وتحديد الظواهر مثل الاستشعار عن النصاب أو انتشار البكتيريا يحتشدون. والمعلومات التي كشفت عنها التجارب المتعددة الأبعاد في المستقبل باستخدام هذا الأسلوب يؤدي إلى توصيف أفضل من السكان الميكروبيةق والتقدم في البحوث الطبية والبيئية.

وقد تطورت البكتريا للرد على العديد من الظروف المجهدة. وثمة سمة عامة من التكيف مع الإجهاد هو تغيير في ديناميات النمو 1،2. وتتميز ديناميات النمو في الغالب من قبل معلمتين: معدل النمو الأسي والوقت الضائع، أي الوقت اللازم للتكيف مع الظروف الجديدة. في حين أن عددا كبيرا من أساليب إنتاجية عالية التركيز على قياسات معدل النمو، وتأخر الوقت غالبا ما تكون المعلمة تجاهلها، على الرغم من أنها هي المعلمة حاسمة لتوصيف التكيف مع الظروف الجديدة. وقد جرت العادة على إجراء القياس الكمي للتكيف مع الظروف المتغيرة باستخدام الطرق اليدوية شاقة 3،4. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير تقنيات متقدمة لتحليل الخلايا واحد 5،6. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب التمييز بين النمو الطبيعي بعد التأخر في النمو (أي تأخر الوقت) 2،3 من النمو البطيء. شيد طريقة الآلي، ScanLag 7، لالتمييز بين هذه الظواهر مماثلة اثنين. وكشفت مثال صارخ على أهمية دراسة توزيع الوقت الضائع تحت العلاج بالمضادات الحيوية. المضادات الحيوية والضغوط أخرى كثيرة قتل الخلايا بنشاط متزايد فقط، وبالتالي، والخلايا التي هي &quot;متخلفة&quot; محمية 8. لرصد تأخر الوقت، يمكن للمرء أن يلاحظ خلايا مفردة تحت المجهر ورصد الوقت لدوري الدرجة الاولى. والعيب الرئيسي لهذه الطريقة هو أن النطاق الزمني ديناميكية محدودة؛ تغطية تلك الخلايا التي تنمو في وقت مبكر السطح بمعدل هائل، وخفض بشكل فعال في نمو الخلايا وقتا أطول مع تأخر. استخدام غرف تدفق تلتف إلى حد ما هذا 5، ولكن يمكن تتبع عدد محدود من الخلايا والتي لا يمكن لاحظ جزء من البكتيريا التي الخروج من مرحلة متخلفة بعد الغالبية العظمى من السكان قد بدأت في الازدياد. على الرغم من هذه القيود، وقد قيمت عدة دراسات تأثير مستوى ديويؤكد fferent على توزيع الوقت الضائع باستخدام المجهر خلية واحدة 9-12. طريقة أخرى لمراقبة توزيع الوقت الضائع من خلال قياسات التعكر 13،14. تزرع العديد من الثقافات موازاة ذلك، بدأت كل من خلية واحدة، في قارئ الكثافة البصرية الذي يقيس عدد من البكتيريا في الثقافة على مر الزمن. هذه الطريقة محدودة بسبب دقة استقراء وإلى عدد من الآبار في طبق من ذهب. وقد تم تطوير أسلوب مؤتمت، ودعا ScanLag، التي تمكن مرات تأخر النمو والتوزيعات الوقت على أن يقسم، حتى بالنسبة لنسبة صغيرة من البكتيريا في عدد السكان التي لديها مرات فارق زمني طويل جدا. ويستند هذا الأسلوب على الكشف عن المستعمرات على لوحات أجار التقليدية المغذيات 15 (الشكل 1). لأتمتة الكشف 16،17 مجموعة من الماسحات الضوئية التجارية 18 التي يتم إخراج البرنامج في المنزل للحصول على دوري الصور من لوحات، وهندسيا. وكان البرنامجتهدف إلى تحليل الصور تلقائيا واستخراج المعلمات الكمي 19،20، مثل الوقت من ظهور كل مستعمرة والنمو الوقت من كل مستعمرة، الذي يعرف هنا باسم الوقت لتنمو من 20 بكسل إلى 80 بكسل. هنا نقدم طريقة بالتفصيل، بما في ذلك الإعداد للنظام واستخدام البرمجيات الآلي تحليل الصور التي تم تحسين واجهة المستخدم مع أفضل. هذه الطريقة يمكن تكييفها لقياس الخصائص الأخرى من المستعمرات، مثل التشكل واللون. وقياس هذه الأنواع من المعلمات السماح باستخدام النظام في phenomics متعددة الأبعاد. كما يكشف الأسلوب مستعمرات من الخلايا واحدة، يمكن للنظام كشف الظواهر الجديدة التي لا يمكن قياسها بواسطة القياسات على مستوى السكان. تقنية تمكن الكشف واسترجاعها من المتغيرات نادرة، ويسهل الكشف عن الصفات المطلوب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

كمثال على استخراج توزيع الوقت الضائع، ويبين الشكل 5 قدرة ScanLag لتحديد وتتبع كل مستعمرة ذات خصائص محددة على لوحة واحدة مع مرور الوقت، كما أن يعاملوك في مقايسة الفرز. عندما ثقافة الكائنات الحية الدقيقة غير المتجانسة، ومجموعات سكانية فرعية مختلفة قد تكشف عن نفسها خلال الفحص. على سبيل المثال، ويبين الشكل 6 الكمي مظهر وبالتالي يكشف توزيع الوقت الضائع في النسقين سلالة متحولة من E. القولونية. معدل نمو الخلايا يؤثر على مظهر الوقت للمستعمرة. عندما تنمو المستعمرات في نفس المعدل، ويمكن أن يعزى ظهور في وقت متأخر إلى الوقت الضائع (الشكل 7). للتحقق من أن الأسلوب بل يقيس الوقت الضائع من الخلايا واحد، ونحن مقارنة النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها ScanLag باستخدام المجهر وحيدة الخلية؛ هذا هو التحقق من صحة تنازلياribed بالتفصيل في نشرة سابقة 7. هذا الأسلوب يتيح رصد العديد من الخلايا مما يمكن تقييمها مع المجهر. التوزيعات التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر والحصول عليها باستخدام ScanLag تتداخل إلى حد كبير. توزيع ScanLag هو أوسع قليلا؛ التحليلات النظرية التنبؤ توسيع لتكون من أجل من الانحراف المعياري من الوقت الانقسام. إذا كان الوقت هو النمو المختلفة لكل سلالة، يجب التحقيق في أصل التأخير في ظهور المزيد من استخدام وسائل أخرى. تم فحص تأثير المستعمرات الظهور المبكر على ظهور المستعمرات في وقت لاحق. أكدت التجارب أن السيطرة 7 في وقت لاحق مظهر لم تتأثر طالما أن العدد الكلي للمستعمرات في لوحة لم تتجاوز 200 (الشكل 8). أكدت التجربة عنصر تحكم آخر أن موقع مستعمرة على لوحة لم تؤثر الوقت مظهره 7. تحليل عيتم معايرة المرحومين إلى عتبات محددة قد تحتاج إلى تعديل تبعا المواد المغذية الموجودة في المتوسطة النمو أو نوع من الكائنات الحية الدقيقة. ومع ذلك، فإن التحليل هو قوي جدا بالنسبة لمجموعة كبيرة من العتبات كما هو مبين في الشكل 9. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. رسم تخطيطي من الخطوات اللازمة لإنشاء توزيع مظهر المستعمرة. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. لقطة شاشة إدارة الأجهزة تظهر أسماء الماسحات الضوئية المرفقة، وملف التكوين. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر</a>نسخة من هذا الرقم. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. لقطة شاشة مدير الضوئي. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. لقطة شاشة ScanLagApp. صورة من لوحة على الجزء الأيمن، ومنحنيات النمو في كل مستعمرة هي في الجزء الأيسر، كما هو مفصل في الدليل. المسامير في بعض المنحنيات منطقة المستعمرات تحدث عند دمج اثنين أو أكثر من المستعمرات. عندما يحدث دمج المستعمرات، ويعتبر مجال هذه المستعمرات على أنها منطقة مشتركة. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. ونتيجة ممثل تحليل لوحة واحدة. (A) صورة من إخراج تطبيق الكشف في نهاية التجربة. يتم تعريف كل منطقة مستعمرة، وتعيين الملونة مع رقم معرف فريد. تشير الأسهم إلى المستعمرات ممثل تقاس B. يتم الكشف عن مستعمرة على أساس عتبة كثافة (للE. المستعمرات القولونية على LB أجار أجار أو M9 هذا الحد هو 0.03. لوسائل الإعلام أو غيرها من البكتيريا، ويمكن تعديل هذه العتبة في ProcessPictures ظيفة ). تحسب فقط كائنات فوق 10 بكسل (يمكن تعديل هذه العتبة في MatchColonies وظيفة). الكشف عن مستعمرة يبدأ في حوالي الساعة 10 5 البكتيريا. (B) المؤامرات في المنطقة بالبكسل مقابل الوقت من أربع مستعمرات ممثل في هذه اللوحة. في &quot;وقت ظهور &#39;من كل مستعمرة هو عندما يتم الكشف عن المستعمرة. يتم تعريف &quot;الوقت النمو &#39;من كل مستعمرة هنا كما الوقت لتنمو جيئة وذهابام 20 بكسل إلى 80 بكسل (تلك حدود قابلة للتعديل باستخدام وظيفة getAppearanceGrowthByVec). البرنامج لا يشمل المستعمرات التي اندمجت قبل الوصول إلى الحد الأعلى. تحديد مستعمرة محددة وفقا لخصائصها ويعود الفضل سهل الى رقم تعريف واللون المخصصة لكل مستعمرة. على سبيل المثال مستعمرات رقم 1، ويسلط الضوء على 56 و 77 و 124 في كل من الرسوم البيانية. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. المظهر الكمي يمكن أن تكشف عن النسقين توزيع الوقت الضائع. مقارنة بين رسوم بيانية تحليل ScanLag مرات ظهور لهما سلالات مختلفة. الخط الأزرق: نوع السلالة البرية المتنامية باطراد (المجموع: 1،320 المستعمرات)؛ أحمر خط عالية استمرار متحولة المخصب مع البكتيريا متخلفة (المجموع: 1،529 المستعمرات). (أ) رسوم بيانية ظهور تطبيع. ذروةمن ظهور الخلايا تنمو باطراد هي المرة نموذجي ليصل إلى مستعمرة كشفها. أقحم: نفس الرسم البياني من سلالة متحولة بعد طرح الوقت من ذروة الثقافة الأسي للحصول على الوقت الضائع الفعلي على صناديق متباعدة سجل تبين توزيع الوقت الضائع النسقين. (B) البقاء على قيد الحياة وظيفة من نفس البيانات كما في (أ) على مقياس لوغاريتمي. هذا التمثيل يعزز أواخر الذيل ظهور سلالة متحولة. <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. توزيع المظهر وتوزيع الوقت النمو. (A) و (B) تظهر رسوم بيانية الأبعاد اثنين من الوقت المظهر والوقت نمو اثنين من ظروف مختلفة (البرنامج لا يشمل المستعمرات التي اندمجت قبل الوصول إلى الحد الأعلى). (C) وبمقارنة رسوم بيانيةمن سلالتين تظهر الفرق في الوقت المظهر، في حين أن النمو مرات (D) متشابهة. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> الرقم 8. ظهور المستعمرات في وقت مبكر لا تتداخل مع ظهور المستعمرات في وقت لاحق. (A) تأخر توزيع الوقت من البرية من نوع الخلايا مطلي وحدها. (ب) تأخر توزيع الوقت من سلالة الحساسة الباردة وحدها، وبعد نقلها إلى درجة حرارة متساهلة. (C) تأخر توزيع الوقت لكل من سلالات مطلي معا تحت نفس الظروف. يمثل خط أسود توزيع المتوقع استنادا إلى البيانات التي تم الحصول عليها عند قياس كل سلالة على حدة. A جيدةيتم الحصول على greement بين التوزيعات المتوقعة وقياس ما دام مجموع عدد المستعمرات في لوحة هو أقل من 200. <img alt="الرقم 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> . الرقم 9 عتبة الكشف لا يؤثر على شكل توزيع مظهر مستعمرة تم تحليل توزيع مظهر مستعمرة لنفس مجموعة البيانات باستخدام اثنين من أحجام مختلفة عتبة؛ (أ) حجم عتبة هو 10 بكسل؛ (ب) حجم عتبة 50 بكسل. عدد الخلايا في الرسم البياني: تقريبا. 1،500. النتائج عتبة الكشف مختلفة فقط في التحول من الوقت الكشف. <img alt="الرقم 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> الرقم 10. درجة الحرارة قياسات الاستقرار ACROSS سطح الماسح الضوئي (أ) صورة من لوحة مع مستعمرات subtillis العصوية نمت على الماسح الضوئي دون إدارة الطاقة. السطح أكثر دفئا في الجزء السفلي، وبالتالي المستعمرات تنمو بشكل أسرع. خط التدريجي بجانب لوحة هو تمثيل التخطيطي التدرج الحراري. (B) وقد تم قياس درجة الحرارة الاستقرار مع اثنين من المزدوجات الحرارية وضعت عبر سطح الماسح الضوئي. الماسح الضوئي مع ارتفاع درجات الحرارة خلال كل من مسح ومع مرور الوقت. (C) وإدارة الطاقة، ودرجة حرارة موحدة والمستعمرات تنمو بمعدلات مماثلة. (D) مثل (B) مع وحدة إدارة الطاقة. استقرار درجة الحرارة من ± 0.2 درجة مئوية. <img alt="الرقم 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> الرقم 11. قد تكون الاختلافات في التوزيع بسبب ظهور ديfferences في أحجام متوسطة الصلبة. كان مطلي نفس الثقافة البكتيرية على لوحات بأحجام مختلفة من LB أجار، مما أدى إلى ارتفاع مختلفة من سطح أجار. قاد ارتفاعات مختلفة إلى التعتيم مختلفة من لوحات، وبالتالي وقت الكشف مختلفة. تم فحص لوحات الفرق بين والفرق بين الارتفاعات المختلفة. (أ) الاختلافات بين نموذجي لوحات من كميات متساوية من 30 ± 0.5 مل من LB آجار. (ب) الفرق بين الارتفاعات المختلفة: تم قياس توزيع مظهر لوحات بأحجام من 20 ± 0.5 مل (الحمراء)، من 30 ± 0.5 مل (الأخضر) و40 ± 0.5 مل (الازرق). كل شرط هو متوسط ​​6 لوحات مختلفة. طالما أن حجم لوحات ضمن نطاق ± 5 مل، غموض مشابه ويؤدي إلى توزيع مماثلة الوقت المظهر.

Watch this Scientific Journal Video about ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time at JoVE.com

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: عالية الإنتاجية الكمي لمستعمرة النمو والفارق الزمني

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Video: ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...