SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-היטב ארוך פריימר PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא קדם 96-היטב קריר PCR במקפיא -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 10 מ&quot;ל, להכין מיקס מאסטר: 2,100 μl DDH 2 O, 105 μl PCR כיתה DMSO, 105 μl 10 מ&quot;מ dNTPs, 105 μl תבנית pPOT (25 ng / μl) 9 עבור בנפח כולל של 2,415 μl לכל צלחת . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 23 μl לבאר כל צלחת 96-היטב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 100 מיקרומטר ונקוו פריימרים לכל טעון היטב בעזרת פיפטה רבה P20 12 ערוץ. חותם עם הסרט, מקום צלחת על קריר PCR מראש צונן ולאפשר להקפיא למשך תקופה מינימלית של 20 דקות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 10 מ&quot;ל, להכין מיקס מאסטר B: 2,048 μl DDH 2 O, 525 μl 10x חיץ, 52.5 פולימראז μl עבור בנפח כולל של 2,626 μl לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת קרירה PCR מהמקפיא -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצלחת עדיין על מקרר PCR, להוסיף 25 μl מיקס מאסטר B על גבי קפאn מיקס מאסטר A עבור נפח תגובה כולל של 50 μl. זהו זמן קריטי, ואת אמור להסתיים לפני לערבב יכול להפשיר. חותם צלחת עם סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר Cycler תרמית כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו תקופת הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת ה- PCR לאחר הבלוק הגיע 94 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. אימות של 96-היטב ארוך פריימר PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עופרת 1% גדול (w / v) agarose ג&#39;ל טריס Acetate EDTA (TAE) הפעלת המאגר במסרקות 4 x 28-גם לתת ג&#39;ל עם 4 שורות של בארות. יישר שיניים חלופיות של המסרק בקצות טפטפו רב 12 ערוץ. בזהירות להטביע את ג&#39;ל בטאי הפעלת המאגר לאחר נתיבים נטענים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם DNA 1 טען kb לתוך -1 ו -28 th היטב של כל שורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב ערוצי P20 12 ערוץ, להעביר 2 μl של dir המוצר PCRectly לכל נתיב של (איור 1 א) ג&#39;ל. עשה זאת מהר כדי לצמצם את האפשרות של זיהום amplicons. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מוצרי ה- PCR משורה א &#39;של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי בעל מספר אי זוגי של השורה ה -1 של ג&#39;ל (A1 - מסלול 3, A2 - מסלול 5 ...... A11 - ליין 23, A12 - ליין 25) ולטעון את מוצרי ה- PCR משורה ב &#39;של הצלחת ה- PCR לתוך נתיבי הזוגיים של שורה 1 st של הג&#39;ל (B1 - מסלול 4, A2 - מסלול 6 ...... B11 - ליין 24, B12 - ליין 26). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מוצרי ה- PCR מן השורה C ו- D של הצלחת ה- PCR באמצעות אותו דפוס כפי שתואר לעיל, עם שורה C לתוך נתיבי האי-זוגיים ושורה D לתוך נתיבי הזוגיים. המשך דפוס טעינה זה עד היטב כל צלחת ה- PCR נטען על ג&#39;ל. חיץ טעינת ה- DNA אינו נדרש לטעון ג&#39;ל זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל לתוך הטנק ריצה למלא את המיכל עם TAE הפעלת המאגר עד ג&#39;ל הוא שקוע. הפעל ב -100 V למשך 30 דקות ולאחרלדמיין באמצעות transilluminator UV. ראה איור 1B עבור ג&#39;ל למשל. הערה: מוצרי ה- PCR יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני transfection </li></ol> 3. Transfection 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ט תא brucei טופס procyclic קו 10 SMOXP9 עבור הליך זה ולגדול התקשורת SDM-79 המכיל 10% 10 FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 x 10 7 תאים לכל transfection (סה&quot;כ 1.1 x 10 9 תאים) בעת תיוג על הקצה האמין של החלבון ו -2 x 10 7 תאים לכל transfection (סה&quot;כ 2.2 x 10 9 תאים) בעת תיוג על התחנה הסופית ג &#39; החלבון. לשמור על התאים ב-יומן באמצע (1.2 x 10 6 -1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל) במשך כמה ימים לפני transfection ו לקצור את התאים עבור transfection בצפיפות של 5-8 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מוצרי ה- PCR קפוא עבור transfection להפשיר בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות haemocytometer או נגד תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה נדרש מספר תאי צינורות 50 מ&quot;ל מספר 800 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה להשליך supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ&quot;ל cytomix שונה (0.8 מ&quot;מ EGTA, 24 KCl מ&quot;מ, 0.15 מ&quot;מ CaCl 2, 10 מ&quot;מ pH7.6 חיץ אשלגן פוספט, 25 מ&quot;מ HEPES-KOH pH7.6, 2.6 מ&quot;מ MgCl 2, 0.5% (w / v) גלוקוז, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA, 1 מ&quot;מ hypoxanthine, 144 סוכרוז מ&quot;מ) לכל צינור. להעביר את כל פתרונות לתא צינור יחיד ספין שוב ב 800 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להשליך supernatant ו resuspend התאים 23 מ&quot;ל של cytomix שונה ריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים ספינינג, להוסיף 1 מ&quot;ל של SDM-79 התקשורת היטב כל 4 x 24 גם צלחות בתרבית רקמה. לייבל צלחות לספירה ולהסיק טבעת סביב היטב A1 על כל צלחת בטוש לסייע להתמצאות צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המטפל הצלחת אל electroporator. על electroporaיחידת טור להגדיר את המתח ל -1,500 V, אורך הפולס ל -100 μsec ומספר פולסים עד 12 ואת המרווח הדופק ל -500 מילי-שניות. על מטפל הצלחת, להגדיר את ספירת הדופק ל -1 זה מבטיח כי electroporator יחול דופק יחיד בין 12 העמודים של צלחת electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב ערוצי ערוץ 12 P200, להעביר את התגובות PCR מהצלחת PCR על צלחות electroporation הפנויה 96-היטב, 4 מ&quot;מ הפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים כבר הסתובב הם resuspended לריכוז סופי של 5 x 10 7 תאים / מ&quot;ל (שלב 3.7), להעביר למאגר מגיב. פיפטה 200 μl של פתרון התא לתוך הבאר כל צלחת electroporation באמצעות פיפטה רב ערוץ 12 P200, לערבב עם מוצר ה- PCR על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רקמות להסיר כל טיפות מהחלק העליון של הצלחת להימנע-קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בסרט איטום מסופק באריזה צלחת לראש צלחת electroporation, positioning זה כדי להשאיר את החורים עבור אלקטרודות שנחשפו בחלק העליון והתחתון של כל עמודה. הימנע מכסה את הנקודות שהועלו נהג להנחות את הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת electroporation לתוך מטפל הצלחת ולסגור את המכסה. &#39;דופק&#39; לחץ על יחידת electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, במהירות ולהעביר את התאים מצלחת electroporation 96-היטב צלחות תרבית 4 x 24 גם רקמה. כדי להעביר את התאים, להשתמש פיפטה רב ערוץ 12 P200 עם כל הטיפ השני חסר כאלה כי 6 טיפים הנותרים ליישר קו עם 6 שורות על צלחת בתרבית רקמה 24 גם. העברת תאי electroporated ב צלחות electroporations 96-היטב תבנית מוגדרת מראש על הצלחות בתרבית רקמת 24 גם (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הטיפים פיפטה P200 - לכל transfection 96-גם להכין 2 קופסאות של 96 טיפים עם כל עמודה אחרים יוסרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 על צלחת electroporation 96-היטבצלחת שורת הצלחות תרבות 24 גם רקמות, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 לתוך שורה B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 לתוך שורה C ו- D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן נשטפים עם התקשורת מבארות מקביל 24- גם צלחת ואת לשטוף מועבר בחזרה אל בארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת B, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 לתוך שורה B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 לתוך שורה C ו- H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת &quot;טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 על צלחת electroporation 96-היטב לשורה C צלחת 24 גם, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 לתוך שורה B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 לתוך שורה C ו- D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מן 96 צלחת &quot;טוב לצלחת 24 באר, בארות בצלחת 96-היטב ולאחר מכן לשטוף עם התקשורת מבארות מקביל צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועבר לאחר מכן חזרה אל בארות בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות העברת E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 על צלחת electroporation 96-היטב 24 גם שורת צלחת D, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 לתוך שורה B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 לתוך שורה C ו- H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 לתוך שורה ד לאחר העברת כל סט של 6 בארות מהצלחת 96-היטב צלחת 24 גם, מהבארות 96 צלחת &quot;טוב הם מכן לשטוף עם תקשורת מבארת המקבילה צלחת 24 היטב בכביסה הוא הועברה לאחר מכן חזרה אל הבארות בצלחת 24 גם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך, לבחון 1 היטב מכל עמודה לבדוק את התאים. יהיו תערובת של תאים חיים ומתים עםכמות משמעותית של פסולת התא. ניתן להבחין בתאי חיים מן התאים מתים משום שהם יהיו בהירים תחת מיקרוסקופ לעומת השלב יתקדמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את 24 גם צלחות בקופסא נקיה, פלסטיק עם מכסה המהווה חותם חזק. להניח את התיבה C חממה 28 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 6-8 שעות מאוחר יותר, להוסיף 1 מ&quot;ל של SDM-79 עם 10% FCS המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית 2x היטב כל אחד. מניסיוננו, שורות תאים שבם הגנים מתויגים על הקצה האמין עמידות ריכוזים גבוהים יותר של תרופה סלקטיבית. לכן, באמצעות blasticidin כדוגמא, תיוג על הקצה האמין דורש ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin ותיוג על התחנה הסופית C דורש ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin. הערה: שורות תאים מהונדסות תהפוכנה 9-10 ימים גלויים לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר לפחות פעמי תרופה טריה תקשורת לפני הניתוח. איור 2B מראה את התוצאות של transfe 96-היטב טיפוסיction לתיוג 96 חלבונים שונים על הקצה האמין. להעריך כל טוב על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לקבוע אם הוא מכיל תאים עמידים בריאים, סמים. באר בריא מכיל בעיקר (&lt;95%) תאים פעילים מאוד כי הם בהירים במיקרוסקופ חוזה שלב. ניתוח לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או כתם המערבי נדרש לקבוע אם החלבון תויג בהצלחה. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שיפור דרמטי את הרגישות של חקר החלבונים ושיטות transcriptomics ב 5-10 השנים האחרונות סיפקה נתונים חשובים על אלפי גנים ומוצריהם. עם זאת, את הכלים כדי להתמודד עם תפקודם של חלבונים אלה לא עמדו בקצב. תיוג חלבון הופך לפשוט ניסויים רבים כדי לקבוע את תפקידו. לדוגמא, חלבון יכול להיות התמזג חלבון פלואורסצנטי במגוון צבעים שונים כדי להקל על מחקרי לוקליזציה שיתוף לוקליזציה. תגיות שפותחו עבור במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון APEX2 או miniSOG 11,12, לאפשר לוקליזציה ultrastructural של החלבון המתויג. תגיות עבור ביוכימיה, כגון תג TAP, ו ProtC-TEV-ProtA (PTP) לתייג 7,13 לאפשר טיהור של מתחמים הקשורים החלבון לזיהוי שותפים מחייבים או מבחני ביוכימיים במבחנה. הצעדים הספציפיים הם קריטיים להצלחת protocol הוא: השילוב של DMSO לתערובת 1 מאסטר PCR, מקפיא של מיקס מאסטר PCR 1 לפני התוספת של מיקס מאסטר 2, השימוש פולימראז המסחרי מיקס מאסטר 2 ואת השינוי של חיץ electroporation cytomix. מניסיוננו, יש צורך להשתמש כפול ממספר תאים עבור transfections תיוג מסוף C ובאשר transfections תיוג מסוף N על מנת להשיג שיעור דומה של בארות חיוביות. לכן, כל הצעדים צריכים להתבצע כפי שתוארו. טכניקה זו עשויה היחידה להצליח כאשר transfecting trypanosome טופס procyclic חרקים. יש צורות דם יעילה transfection נמוך 14, יתר על כן הם צפויים למות במהלך בחירה בשל רעילויות צפיפות תלויה כי אינה קשורה לתרופה סלקטיבית. לכן, הפרוטוקול הקודם שלנו מייצג את הטכנולוגיה הטובה ביותר הנוכחית עבור תיוג של trypanosomes טופס דם 9. כמו כן סביר להניח כי טרנסיעילות fection תשתנה תלוי לבודד trypanosome הספציפי. פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות 927 SMOX צורות procyclic - זנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. צעדים שעשויים להגביר את סיכויי הצלחת כוללים: הגדלת הסכום של amplicon PCR, הגדלת מספר התאים הכלולים transfection. אנו מציגים שיטה שבה מאה חלבונים יכולים להיות מתויגות במקביל. זה יקל מחקרים בקנה מידה גדול על לוקליזציה ואינטראקציה, המשלימה מערכי נתונים גדולים קיימים ומתן מידע שלא יסולא בפז לקהילה. תבניות פריימר יימסרו לכל מבקש ורשימת תבניות פלסמידים זמין מ: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei הוא טפיל protozoan שגורמת trypanosomasis אדם אפריקאי nagana בבקר. ט brucei הוא אורגניזם אידיאלי לניתוח תפקוד חלבון עקב השילוב של הגנום באיכות גבוהה, פרוטאומיקה רב מערכי נתוני transcriptomics וכלים מולקולריים מפותחים 1-3. התקדמות פרוטאומיקה וסדר גרמה מערכי נתונים גדולים המדגישים גנים מעניינים פוטנציאל 4-6; יש עם זאת, גנים רבים מידע מינימאלי הקשורים בהם במסדי הנתונים הקיימים. לכן יש צורך שיטת תפוקה גבוהה כדי לסייע ואפיון חלבונים פונקציונלי. ביטוי של חלבון מתויג יכול לתת ריבוי תובנה הפונקציה של חלבון. לדוגמה, חלבון מסומן בחלבון או epitope ניאון יכול להיות מקומי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר נותן מידע על המקום ממנו protעין עלולה להיות הפעלת ההשפעה הביולוגית שלה. לחלופין, חלבון מתויג עם ברז 7, HaloTag 8 או התג שלו יכול להיות מטוהר עבור מבחני ביוכימיים ואיתור שותפי האינטראקציה שלה. אנחנו לאחרונה פתחנו מתודולוגיה תיוג חזקה ט brucei 9. זה זמן רב בשימוש פריימר PCR על מנת ליצור את ה- DNA עבור transfection ואפשר התיוג של עשרות חלבונים במקביל - שיפור משמעותי כדי פרוטוקולים קיימים. עכשיו שיפרנו את יכולת ההרחבה של פרוטוקול זה בצורות procyclic ידי סדר גודל. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו שבו אנחנו מבצעים את PCR ו transfection לתוך צלחות 96-היטב, עם ההתאוששות והבחירה המתרחשים 24 גם צלחות. צירופם של מאות חלבונים יכול עכשיו להיות מתויג במקביל שיטה זו מספקת חסכונית ריאלי שיטה תיוג הגנום trypanosome כולו.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

בשנת transfection נציג זה, פריימרים תוכננו באמצעות סקריפט perl תגית 9 ו מסונתז מסחרית. 96-גם PCR בוצע ומאומת כמתואר (איור 1 א); בדוגמה זו, 95/96 PCRs היו מוצלחים (איור 1B). מניסיוננו, חוזר תגובות נכשלו גם עם פריימרים המקורי או פריימרים-מסונתז מחדש לא לגרום PCR מוצלח. Amplicons הועבר לתוך צלחות electroporation 96-היטב עבור electroporation (איור 2 א) ולאחר מכן מועבר צלחות תרבות 24 גם להתאוששות ובחירה. אחרי מספיק זמן כדי לאפשר את הבחירה להתרחש, הבארות דורגו להישרדות לפני ניתוח נוסף. בדוגמה זו, 88/96 בארות (92%) היו חיוביות לאחר בחירת 15 ימים. <ialt מ&quot;ג = &quot;איור 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1: אימות של פריימר ארוך PCR (א) תבנית להעברת מוצרים PCR מ 96-גם צלחת PCR על ג&#39;ל agarose למתן תוקף של PCR.. (ב) ג&#39;ל אימות 96-היטב PCR נציג תיוג 95 גנים על הקצה האמין, ו -1 amplicon המכיל מס &#39;5 &quot;הומולוגית מיקוד לפעול כביקורת שלילית transfection. הדגימות הועמסו על 1% (w / v) agarose ג&#39;ל והחליטו ב -100 V למשך 30 דקות. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> איור 2: 96-היטב electroporation ובחירה (א) תבנית להעברת תאי electroporated מ -96 היטב plat electroporation.דואר צלחות בתרבית רקמה 24 גם. (ב) סכימטי מראה ניקוד חי / מת בדרך כלל אחרי 15 ימים של בחירת 24 גם צלחות. הירוק מייצג transfection מוצלח, אפור מייצג היטב עם תאים מתים בלבד. בדוגמא זו, 88/96 (92%) של בארות כלולות טפילי transfected בהצלחה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Views.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Video: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

בחינת מבנה ה-G-הסככה הטלומרים ב Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genetics

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

במבחנה בדיקת סמים נגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biochemistry

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

פיתוח חיישן מבוסס pHluorin2 עבור pH גליקוזומלי ב Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

מחבר זרקור: התקדמות בניטור pH גליקוזומלי ב Trypanosoma brucei באמצעות pHluorin2 Biosensor

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

תפוקה גבוהה ג'ין תיוג ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בחינת מבנה ה-G-הסככה הטלומרים ב Trypanosoma brucei

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

מניפולציה גנטית ב

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

במבחנה בדיקת סמים נגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

איתור של

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי