We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1. Construir o Setup <ol><li> Escolha um scanner de mesa com resolução óptica: 4800 dpi; Resolução Hardware: 4800 x 9600 dpi; bits de cor: 48 bit, que pode operar em níveis de temperatura e umidade relevantes. </li><li> Placas de Petri tem volume significativo, ao contrário do papel normalmente usado em scanners comerciais. As colónias de deitar por cima da camada de agar, cerca de 5 mm acima da superfície do scanner. Nota: Para a maioria dos scanners das colônias estarão em foco. </li><li> Algumas empresas de scanner não permitir a conexão de mais de uma instância do scanner do mesmo tipo para o mesmo computador. Certifique-se de que mais de um scanner pode ser ligado e identificado de forma única. </li><li> Prepare os acessórios, conforme detalhado a seguir: <ol><li> Preparar pedaços de pano de feltro preto estéril para cobrir as placas (Figura 1 passo 2). </li><li> Para segurar as placas de Petri no lugar, preparar os titulares placa branca (Materiais e Métodos) que se encaixam os scanners e que tem 6 holes do tamanho das antenas (Figura 1 passo 3). </li></ol></li><li> Se necessário para o crescimento do microrganismo, colocar os scanners num ambiente de temperatura controlada. Conecte os scanners para o computador. </li><li> Opcional: Ligue o relé para o computador e ignorar o interruptor on / off do scanner para superar gradiente de temperatura. Nota: A unidade de relé é para temperatura extremamente sensível microorganismos. Ele desliga o scanner de modo que o sistema eletrônico não aquecer a superfície de forma desigual. Usando apenas uma parte da superfície do scanner pode obter resultados semelhantes. </li></ol> 2. Instalar o Gerenciador de Digitalização <ol><li> Copie todos os arquivos do aplicativo de digitalização &#39;Manager&#39; em um diretório designado de http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Configurar o arquivo ScanningManager.exe.config acordo com os nomes scanners como aparecem no computador de gerenciamento-&gt; Gerenciador de Dispositivos-&gt; Imaging Devices ( <strong&gt; Figura 2). </li><li> Para solução de problemas da aplicação &#39;Scanning Manager&#39;, consulte o arquivo leia-me. </li><li> Para mais documentação sobre a aplicação &#39;Scanning Manager&#39;, consulte documentation.html. </li></ol> 3. Fazer um experimento <ol><li> Preparar os pratos de Petri (Figura 1): <ol><li> Dilui-se a cultura a cerca de 2000 CFU / ml. Placa de 0,1 ml de cultura de forma uniforme sobre a superfície da placa. </li><li> Para obter um bom contraste entre as colônias e do prato e para absorver a umidade, cobrir a placa com um pedaço de pano preto estéril sentia. Coloque a tampa sobre a placa. </li></ol></li><li> Coloque as placas nos suportes sobre os scanners. </li><li> Inicie o Gerenciador de digitalização (Figura 3): Escolha os scanners que participam da lista de scanners anexados. Escolha o número de imagens a serem tomadas (repetições), o intervalo de tempo entre as imagens subseqüentes (gap Time), eo tempo de espera antes de começar tele experimentar (Comece After). </li></ol> 4. Análise das imagens NOTA: Um esboço de métodos computacionais é fornecida para analisar as imagens em MATLAB usando &quot;ScanLag&quot;, que está disponível gratuitamente para uso não-comercial em http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Outras funções disponíveis estão detalhadas no manual do software, e um código de exemplo é complementado. <ol><li> Classificar as imagens de cada scanner em pastas separadas. </li><li> Usando a janela de comando do Matlab, execute os seguintes procedimentos. Os parâmetros necessários para executar esses procedimentos são definidos no manual do software. <ol><li> Execute PreparePictures para realizar o pré-processamento: No pré-processamento, as imagens de um scanner estão alinhados. Cada placa de Petri é colhida de cada seqüência de imagens. O momento em que cada imagem foi coletado é recuperado do timestamp. </li><li> TLAllPlates de execução para executar a detecção e rastreamento de e Inach Petri separadamente, as colônias são detectados e atribuído um número de identificação. </li><li> A análise dos dados extraídos: Os tamanhos de todas as colónias detectadas são medidos como uma função do tempo. Para extrair a distribuição aparência das colônias utilizar as seguintes funções na janela de comando do Matlab (mais informações estão disponíveis no manual do software): <ol><li> Executar ScanLagApp para exibir a análise de uma determinada placa de Petri juntamente com o gráfico do tamanho das colónias em função do tempo (Figura 4). <ol><li> Use o controle deslizante para alterar o horário atual da placa. A temporização será também indicada por uma linha vertical no gráfico correspondente área colónias. </li><li> Clique em uma colônia para ver a sua curva de associado, e vice-versa, clique em uma curva para encontrar sua colônia associado. Depois de identificar a colônia, o fenótipo pode ser recuperada por escolher a colônia da placa de Petri identificados. </li><li> Defeitos de filtro na análise automática por Choocantar uma colônia e clicando no botão excluir. Ao clicar excluir o número da colônia ficará amarela. </li></ol></li><li> Depois de passar através dos resultados da análise de cada uma das placas, resumem os resultados: <ol><li> Execute AddHistograms criar um histograma de vezes de aparência. </li><li> Executar plotDeathCurve para criar uma representação da curva de sobrevivência da distribuição. </li><li> Execute GetAppearanceTimes para obter o tempo de aparecimento de todas as colônias no experimento. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phenotypic+characterization+of+bacteria.">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li><li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Nature+of+Bacterial+Lag.">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li><li>Powell, E. 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Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner.">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Métodos microscópicos com base na observação direta são muitas vezes consideradas como o &quot;padrão ouro&quot; para estudar o comportamento de uma única célula. ScanLag, que permite a medição da distribuição dos tempos de espera nas populações bacterianas, fornece dados em boa concordância com a distribuição obtida a partir da análise de uma única célula e que atinge estatísticas muito mais elevadas. Vários passos importantes devem ser realizados para que esse método funcione bem: em primeiro lugar, não comprometer a resolução do scanner, que deve ser de 4.800 x 9.600 para obter boas imagens. Em segundo lugar, ter consciência de que, sem o módulo de gerenciamento de energia (passo 1.6), gradiente de temperatura pode se desenvolver na superfície de mesa e afetar o crescimento. Outro passo importante é a filtração de defeitos, tais como poeira, que podem ter sido erroneamente contados como colónias pelo software. A built-in subtração de fundo do software geralmente supera esses defeitos, mas colônias às vezes &quot;falsos&quot; têm deFiltrou-se manualmente. Os principais passos para solucionar problemas pode resolver variação inter-placa no setup, devido a várias razões: (a) A taxa de crescimento de microorganismos é afetada pela temperatura. As diferentes condições de temperatura e umidade pode ocorrer devido a ventilação irregular ou localização do prato na incubadora. (B) A electrónica do scanner pode aquecer e provocar um gradiente de temperatura em toda a superfície do scanner. Figura 10 mostra a influência de tais gradiente térmico espacial em bactérias Bacillus, juntamente com as medições da temperatura na superfície do scanner antes e após a implementação do módulo de gerenciamento de energia (passo 1.6). Note-se que este módulo pode não ser necessário para scanners mais recentes, e se apenas uma parte da superfície do scanner é usado, gerenciamento de energia pode ser desnecessário. (C) As placas com diferentes opacidade do nutriente agar pode levar a diferentes níveis de detecção. Figura 11 mostra the tolerância para diferentes volumes de agar nutriente, que resultam em diferentes opacidades. Experimentalmente a técnica ScanLag é fácil de executar e requer apenas a placa de microrganismos em placas de Petri padrão, e colocá-las na superfície do scanner. O software que foi desenvolvido controla todo o procedimento. A aquisição das imagens é feita automaticamente, ea análise de imagem para rastreamento de colônia também é automático. Além disso, o sistema pode ser ampliado para medir a muitas condições diferentes ao mesmo tempo. Finalmente, o processo baseia-se em scanners de escritórios comerciais e, portanto, é de baixo custo. Esta técnica pode ser estendida para o estudo de microrganismos que diferem a partir de E. coli K-12, no entanto, várias considerações têm que ser feitas. Em primeiro lugar, a influência das colônias aparecendo no início os posteriores tem de ser avaliado, conforme descrito em detalhes em uma publicação anterior 7. Para E. Coli K-12, adensidade máxima de UFC por placa é de 200. Outras cepas com diferentes tamanhos de colônias, e outras conversas cruzadas possível entre colônias, pode exigir uma densidade diferente. Em segundo lugar, a análise das placas é calibrado para limiares de software baseada específicos que podem precisar de ser modificados, de acordo com o contraste entre o meio sólido e as colónias. O software pode ser estendido também para extrair outras características da colônia, além de atraso e taxa de crescimento. O código de software é aberta e pode ser modificado para se extrair a forma de colónias, brilho, suavidade e cor. Como as medições são feitas sobre as colónias que se originam a partir de células individuais, os dados revelam novos fenótipos que não podem ser medidas por meio de medições de nível de população. A importância da distribuição do tempo de latência é revelado na presença de antibióticos. Muitos antibióticos são conhecidos para ser eficaz apenas contra células de crescimento; Por conseguinte, desde que as células permanecem na fase de latência e não crescem, são pródetectado a partir de efeitos de tais antibióticos 21. Quando o número de bactérias sobreviventes são avaliadas a intervalos de tempo durante o tratamento com antibióticos 15,22,23, uma subpopulação de bactérias, denominado persistentes, muitas vezes é revelada. Em certos casos, a imunidade ao tratamento com antibióticos se origina a partir de atraso prolongado. Usando esta configuração, este atraso é revelado e muitas vezes tem uma distribuição não-trivial 24 (Figura 6). Este método também permite a recuperação de mutantes raras. Por exemplo, após o plaqueamento de uma população mutagenizada, os mutantes podem ser identificadas com base no fenótipo e isolado directamente, sem selecção. A configuração pode também controlar as interacções célula-célula através da medição do crescimento de colónias como uma função da densidade de colónias nas proximidades e quantificar fenómenos tais como quorum sensing ou a propagação de bactérias que infestam. Informações Multidimensional descoberto por futuros experimentos utilizando este método vai levar a melhor caracterização da população microbianas e aos avanços na pesquisa médica e ambiental.

As bactérias têm evoluído para responder a muitas condições estressantes. Uma característica geral da adaptação ao estresse é uma mudança na dinâmica de crescimento 1,2. A dinâmica de crescimento são caracterizados principalmente por dois parâmetros: a taxa de crescimento exponencial eo tempo de latência, ou seja, o tempo necessário para se adaptar às novas condições. Considerando que um grande número de métodos de alto rendimento concentrar nas medições da taxa de crescimento, o tempo de latência é geralmente um parâmetro negligenciado, embora seja o parâmetro crucial para a caracterização da adaptação às novas condições. Quantificação da adaptação às condições de mudança tem sido tradicionalmente realizada utilizando métodos manuais trabalhosas 3,4. Mais recentemente, as técnicas avançadas têm sido desenvolvidos para a análise de células individuais 5,6. No entanto, ainda é difícil distinguir o crescimento normal após um atraso de crescimento (ou seja, um tempo de atraso) 2,3 de crescimento lento. Um método automatizado foi construído, ScanLag 7, adiscriminar entre estes dois fenótipos semelhantes. Um exemplo marcante da importância do estudo da distribuição de tempo de atraso é revelado sob tratamento com antibióticos. Antibióticos e outros stresses Muitos matar células apenas em crescimento activo, e, por conseguinte, as células que são &quot;mais atrasadas&quot; são protegidos 8. Para monitorar o tempo de atraso, pode-se observar células individuais sob um microscópio e monitorar o tempo para a primeira divisão. Uma grande desvantagem deste método é que o intervalo de tempo dinâmica é limitada; as células que estão em crescimento precoce cobrir a superfície a uma taxa exponencial, diminuindo eficazmente o crescimento de células com tempo de atraso. O uso de câmaras de fluxo um tanto contorna este 5, mas um número limitado de células podem ser rastreadas e a fracção de bactérias que saem da fase de retardamento depois de a maioria da população começou a crescer não pode ser observado. Apesar destas limitações, vários estudos avaliaram a influência do nível de different salienta sobre a distribuição de tempo de atraso por microscopia única célula 9-12. Outra forma de monitorar a distribuição de tempo de atraso é através de medições de turbidez 13,14. Muitas culturas paralelas, cada iniciados a partir de uma única célula, são cultivadas em um leitor de densidade óptica que mede o número de bactérias em cultura ao longo do tempo. Este método está limitado pela precisão de extrapolação e de o número de poços num prato. Um método automatizado foi desenvolvido, chamado ScanLag, que permite que os tempos de atraso e distribuições de tempo de crescimento a ser avaliado, mesmo para a pequena percentagem de bactérias em uma população que têm tempos muito longos lag. O método é baseado na detecção de colónias sobre placas de agar nutriente convencional 15 (Figura 1). Para automatizar a detecção de 16,17 uma série de scanners comerciais 18 que são dirigidos por software em casa para adquirir periodicamente imagens das placas, foi projetado. Software foiconcebido para analisar automaticamente as imagens e extrair os parâmetros quantitativos 19,20, tais como o tempo de aparecimento de cada vez e o crescimento de colónias de cada colónia, o que é aqui definido como o tempo necessário para passar de 20 pixels de 80 pixels. Aqui apresenta-se o método em detalhe, incluindo a instalação do sistema e a utilização de software de análise de imagem automatizado, que tem sido melhorada com um interface de utilizador melhor. Este método pode ser adaptado para medir outras características de colónias, tais como morfologia e cor. A medição destes tipos de parâmetros vai permitir o uso do sistema de phenomics multidimensionais. Como o método detecta colónias a partir de células individuais, o sistema pode revelar novos fenótipos que não podem ser medidas por meio de medições de nível de população. A técnica permite a detecção e recuperação de variantes raras, e facilita a triagem para as características desejadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Como um exemplo da distribuição do tempo de desfasamento de extracção, a Figura 5 mostra a capacidade de ScanLag para identificar e rastrear cada colónia com características específicas em uma placa ao longo do tempo, tal como seria feito num ensaio de rastreio. Quando a cultura do microorganismo é heterogénea, as diferentes subpopulações pode revelar-se durante o ensaio. Por exemplo, a Figura 6 mostra a quantificação aparência e, consequentemente, revela distribuição bimodal de tempo de atraso em uma estirpe mutante de E. coli. A taxa de crescimento das células influencia o tempo de aparecimento da colónia. Quando as colónias crescem à mesma taxa, o aspecto final pode ser atribuída ao tempo de atraso (Figura 7). Para validar que o método de fato mede o tempo de atraso de células individuais, comparamos os resultados com os obtidos ScanLag usando microscopia de uma única célula; esta validação é described em detalhes em uma publicação anterior 7. Este método permite a monitorização de muito mais do que as células podem ser avaliadas por microscopia. As distribuições obtidas por microscopia e obtido usando ScanLag em grande parte se sobrepõem. A distribuição ScanLag é um pouco mais amplo; análises teóricas prever alargamento para ser da ordem do desvio padrão do tempo de divisão. Se o tempo de crescimento é diferente para cada estirpe, a origem do atraso da aparência deve ser investigado através de outros métodos. A influência de colónias de aspecto início no aparecimento de colónias foi posteriormente examinada. As experiências de controlo 7 confirmou que o aparecimento posterior não foi afectada, enquanto o número total de colónias por placa não exceder 200 (Figura 8). Uma outra experiência de contraprova confirmaram que a localização da colónia na placa não afectava o tempo de aparecimento 7. A análise da plates é calibrado a limites específicos, que podem requerer modificação dependendo nutrientes presentes no meio de crescimento ou o tipo de microorganismo. No entanto, a análise é muito robusto para uma ampla gama de limites, conforme mostrado na Figura 9. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Um diagrama esquemático dos passos necessários para criar uma distribuição aparência colônia. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Uma captura de tela do Gerenciador de Dispositivos mostrando os nomes dos scanners anexados, e do arquivo de configuração. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Uma captura de tela do Gerenciador de digitalização. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Uma captura de tela da ScanLagApp. Uma imagem da placa está no painel esquerdo, e as curvas de crescimento de cada colônia estão no painel da direita, conforme detalhado no manual. Os picos em algumas das curvas de área colônias ocorre quando duas ou mais colônias fundir. Quando a fusão de colónias acontece, a área destas colónias é considerada como a zona de união. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Um resultado representativo da análise de uma placa. (A) Uma imagem de saída da aplicação de detecção, no final da experiência. Cada área de colônia é identificado, colorido e atribuído um número de identificação único. As setas apontam para colónias representativos medidos em B. A colónia é detectada com base na intensidade de limiar (para as colónias de E. coli em agar LB ou agar M9 este limite é de 0,03. Para outros meios de comunicação ou de bactérias, este limite pode ser ajustado em função das ProcessPictures ). Apenas os objectos acima de 10 pixels são contados (este limiar pode ser modificado em função das MatchColonies). A detecção de uma colónia começa em cerca de 10 5 bactérias. (B) A representação gráfica da área em pixels versus o tempo de quatro colônias representativas desta placa. O &quot;tempo de aparência&quot; de cada colônia é quando a colônia é detectado. O &quot;tempo de crescimento &#39;de cada colónia é aqui definido como o tempo para crescer from 20 pixels e 80 pixels (esses limites são ajustáveis ​​utilizando a função getAppearanceGrowthByVec). O software exclui as colônias que se fundiram antes de atingir o limite superior. Identificação de uma colônia específica de acordo com suas características é fácil graças ao número de identificação e da cor atribuída a cada colônia. Por exemplo colônias º 1, 56, 77 e 124 são destacadas em ambos os gráficos. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Aspecto quantificação pode revelar distribuição do tempo de atraso bimodal. Comparação dos histogramas de análise ScanLag de vezes de aparência para duas tensões diferentes. Linha azul: cepa selvagem crescimento exponencial (Total: 1.320 colônias); linha de alta persistência mutante vermelho enriquecido com bactérias atraso (Total: 1.529 colônias). (A) histogramas aparência normalizado. O picode aparecimento de células em crescimento exponencial é o tempo típico para crescer a uma colónia detectável. Detalhe: mesmo histograma da estirpe mutante depois de subtrair o tempo do pico da cultura exponencial para obter o intervalo de tempo real em caixas-espaçada log mostrando a distribuição do tempo de atraso bimodal. (B) A função de sobrevivência dos mesmos dados em (A) em uma escala logarítmica. Esta representação melhora a aparência da cauda final da estirpe mutante. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Distribuição Aparência e distribuição do tempo de crescimento. (A) e (B) mostram dois histogramas dimensionais do tempo de aparecimento e o tempo de crescimento das duas condições diferentes (O software exclui colónias que se fundiram antes de atingir o limite superior). (C) A comparação dos histogramasdas duas estirpes mostram a diferença de tempo aparência, enquanto que os tempos de crescimento (D) são semelhantes. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. O aparecimento das primeiras colónias não interfere com o aparecimento de colónias posteriores. (A) ficam a distribuição do tempo de células de tipo selvagem plaqueadas sozinho. (B) ficar para distribuição do tempo de uma cepa sensível frio sozinho, após a transferência para a temperatura permissiva. (C) ficam para distribuição do tempo de ambas as linhagens banhado juntos sob as mesmas condições. A linha preta representa a distribuição de esperar com base nos dados obtidos, quando a medição de cada estirpe em separado. Um bom umCORDO entre distribuições esperados e medidos é obtido desde que o número total de colónias por placa é inferior a 200. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Figura 9 O limiar de detecção de não afectar a forma da distribuição aparência colónia A distribuição aparecimento de colónias foi analisado para o mesmo conjunto de dados usando duas dimensões de diferentes patamares; (A) o tamanho limite é de 10 pixels; (B) o tamanho limite é de 50 pixels. Número de células por histograma: aprox. 1500. O limiar de detecção diferente resulta apenas num desvio do tempo de detecção. <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Figura 10. Temperatura medições de estabilidade across superfície do scanner. (A) Imagem de uma placa com colônias de Bacillus subtilis cultivadas no scanner sem gerenciamento de energia. A superfície é mais quente na parte inferior e, por conseguinte, as colónias crescem mais rapidamente. A linha gradual ao lado da placa é uma representação esquemática do gradiente térmico. (B) A estabilidade da temperatura foi medida com dois termopares colocados em toda a superfície do scanner. O scanner aquece durante cada varredura e ao longo do tempo. (C) Com gerenciamento de energia, a temperatura é uniforme e as colônias crescer a taxas similares. (D) O mesmo que (B) com o módulo de gerenciamento de energia. Estabilidade de temperatura de ± 0,2 ° C. <img alt="Figura 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Figura 11. Diferenças na distribuição de aparência pode ser devido a direnças nos volumes de meio sólido. A mesma cultura bacteriana foi plaqueada em placas com diferentes volumes de ágar LB, resultando numa altura diferente da superfície do agar. As diferentes alturas levou a opacidade diferente das placas, e, por conseguinte, um tempo de detecção diferentes. A diferença entre as placas foi verificada e que a diferença entre as diferentes condições de altura. (A) As diferenças comuns entre as placas de volumes iguais de 30 ± 0,5 ml de agar LB. (B) A diferença entre as diferentes condições de altura: a distribuição aparência foi medido para as placas com volumes de 20 ± 0,5 ml (vermelhas), de 30 ± 0,5 ml (verde) e de 40 ± 0,5 ml (azuis). Cada estado representa a média de 6 placas diferentes. Enquanto o volume das chapas está dentro de ± gama de 5 ml, a opacidade é semelhante e leva à distribuição do tempo de aparência semelhante.

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: de alta capacidade Quantificação do crescimento da colônia e intervalo de tempo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...