Este protocolo utiliza CRISPR-Cas9 para crear líneas knock-out o knock-in. La principal ventaja de esta técnica es que es simple y eficiente seguir especialmente para los investigadores principiantes. Para el passaging celular, trate las células cultivadas durante la noche con dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA por placa a 37 grados Celsius durante dos minutos.
Cuando las células se hayan levantado de los fondos de las placas, neutralice la reacción enzimática con dos mililitros de medio de cultivo celular y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico. Recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo celular fresco para el conteo. Luego sembra 1.8 veces 10 a las quintas células en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos para el cultivo nocturno a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono.
Para la transfección de las células, añadir un volumen adecuado de mezcla de transfección que contenga la concentración adecuada de plásmido CRISPR al volumen adecuado de reactivo de transfección, de acuerdo con el diseño experimental y las instrucciones del fabricante. Después de incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante el período de tiempo recomendado, agregue la solución a las células de una manera a gota. A continuación, gire suavemente la placa para mezclar y colocar la placa en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Al final de la transfección, añadir 150 microlitros de trippsina-EDTA para disociar las células como acaba de demostrar y recoger las células separadas por centrifugación. Resuspender el pellet en suero bovino 2%fetal en PBS y filtrar las células a través de un colador de malla de 30 micrómetros en una clasificación celular activada por fluorescencia de cinco mililitros, o tubo FACS. A continuación, utilice las células no trans infectadas para establecer una puerta de control negativa en el citómetro de flujo y clasificar las células trans infectadas de acuerdo con el marcador fluorescente en el plásmido CRISPR utilizado para la transfección en un tubo que contiene 100 microlitros del medio de cultivo celular.
Cuando se hayan recogido todas las células trans infectadas, pelete las células por centrifugación a máxima velocidad y resusppend el pellet en 300 microlitros del medio de cultivo celular. Siembra 200 microlitros de células en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos y permite que las células se recuperen durante unos días en una incubadora de 37 grados Celsius. Peleci con los 100 microlitros restantes de células clasificados a velocidad máxima durante cinco minutos y extraiga el ADN genómico del pellet resultante de acuerdo con los protocolos estándar de extracción de ADN.
A continuación, añada 10 microlitros de tampón de reacción en cadena de polimerasa, un microlitro de mezcla de desoxinucleótido, 2,5 microlitros de imprimación inversa definida por el usuario, 0,5 microlitros de ADN polimerasa, dos a cinco microlitros de la plantilla de ADN genómico extraído y suficiente agua destilada doble para llevar la reacción a un volumen final de 50 microlitros. Ejecute la mezcla en un ciclor térmico y resuelva la reacción en un gel de 2% de agarosa utilizando un tampón 1X TAE de acuerdo con los protocolos estándar. Utilice un bisturí limpio y afilado para extirpar el producto de reacción de la cadena de polimerasa y purificar el ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Mida la concentración del producto utilizando un espectrofotómetro a una absorbancia de 260 nanómetros. Preparar una mezcla de ensayo que contenga 200 nanogramos del ADN aislado, dos microlitros de T7 endonucleasa I tampón de reacción, y suficiente agua doble destilada para llevar el volumen final de la mezcla a 19 microlitros. Reanneal el producto de reacción en cadena de la polimerasa en un ciclor térmico a los parámetros indicados y mezclar cinco unidades de T7 endonucleasa I con el producto reannealed para una incubación de 50 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, resuelva el ADN digerido en un gel de 2,5% de agarosa usando un tampón 1X TAE, e imagine el gel en un sistema de imágenes de gel adecuado. Abra la imagen de gel en ImageJ y dibuje una caja rectangular alrededor de la banda lo más cerca posible de su límite. Haga clic en Analizar y Establecer medidas, confirmando que las opciones de área, valor gris medio y densidad integrada están activadas.
Haga clic en Aceptar y seleccione Analizar y Medir. La media, o el valor de densidad de intensidad bruta, es indicativo de la intensidad de la banda. Cuando las células trans infectadas de cultivo comienzan a ser confluentes, desprende con tripina-EDTA, como se ha demostrado, y sembrar las células escasamente en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros para permitir que crezca suficiente espacio para que las colonias individuales crezcan antes de devolver las células a la incubadora de cultivo celular.
Cuando las colonias comiencen a formarse, utilice un microscopio con un aumento de cuatro X para recoger las colonias individuales para transferirse a pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene 500 microlitros de medio de cultivo celular por pozo. Tenga cuidado de que su punta no toque las colonias circundantes para evitar la mezcla de colonias dentro de pozos individuales o elegir entre un área de crecimiento de colonias escasas. Cuando todos los clones hayan sido seleccionados, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular hasta que los cultivos se vuelvan confluentes.
Como los plásmidos no digeridos están super-enrollados, tienden a funcionar más rápido que sus contrapartes linealizadas. Para determinar si los oligonucleótidos se han clonado con éxito en la columna vertebral del plásmido CRISPR, se realiza la pcR de la colonia y se inoculan los clones positivos antes de que los plásmidos se extraigan y se envíen para la secuenciación de Sanger. La señal fluorescente se puede visualizar fácilmente bajo un microscopio tras una entrega exitosa de los plásmidos, lo que permite ordenar las células trans infectadas por citometría de flujo.
Se realiza un ensayo de endonucleasa T7 I para comprobar la eficiencia del escote del ADN genómico, calculado a partir de las intensidades de las bandas observadas en un gel de agarosa. Además, si un experimento basado en la reparación dirigido por la homología está diseñado para incorporar un sitio de restricción en el locus objetivo, se puede realizar un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción con una enzima de restricción correspondiente. Para validar aún más que un gen de codificación de proteínas se ha inactivado con éxito, se puede llevar a cabo una mancha occidental para garantizar que no haya ninguna proteína dirigida.
La clasificación de las células después de la transfección elimina las células sin plásmidos incorporados, aumentando así el porcentaje de células examinadas en etapas posteriores como que tienen un gen eliminatoria o knock-in. Con el desarrollo de esta técnica, ahora somos capaces de producir líneas celulares knock-out para estudiar la función génica y llamar a las líneas celulares para modelar enfermedades específicas para entender su mecanismo.
