Agradecemos a todo el personal de la planta de secuenciación de alto rendimiento IGBMC, miembro del consorcio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) y todos los servicios generales de IGBMC en particular el personal de la instalación animal IGBMC. Este trabajo fue financiado por becas del CNRS, INSERM, la AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, los franceses del estado fondo a través de la ANR en el programa Investissements Avenir con ANR-10-IDEX-0002-02, la empresa Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 y la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. S.J fue apoyado por la Ligue Nationale contre le cáncer de la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 y V.U por el Ministère de l ' enseignement et de la Recherche. ID es un 'équipe labellisée' de la Ligue Nationale contre le cáncer.

ratones fueron mantenidos de conformidad con las directrices institucionales sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con directrices nacionales de cuidado Animal (Comisión Directiva 86/609/CEE; El francés decreto no.87-848). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Nacional de ética francés.
 1. aislamiento de tejido muscular <ol><li>sacrificio adultos 6 a 8 semanas de edad ratón por dislocación cervical. Sterlise la extremidad por lavado con etanol al 70% y disecar los músculos de extremidades (gastrocnemio, tibial Anterior, cuadriceps) utilizando tijeras de punta fina y fórceps. 
	Nota: Un ratón debe generar alrededor de 500 mg de tejido.</li>
	<li>Pique los músculos en un tubo de ensayo 2 mL que contiene 1 mL de tampón hipotónico helada a una preparación homogénea de pequeño (&#60; 2-3 mm 3) piezas finas tijeras y dejar el tubo de agitación en un agitador de Banco superior a 4 ° C durante 5-10 min</li>
</ol> 2. Lisis de tejido Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Traslado el homogenizado a un tubo de fondo redondo de 14 mL y resuspender en tampón hipotónico frío (libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel y PMSF) de 5 mL.
	<ol><li>Homogenise tejido muscular picada mediante un flojo dounce (20-30 movimientos dentro de 3 minutos) o un homogeneizador de tejidos mecánicos para 15-30 s en tubos de fondo redondo 14 mL. 
		Nota: La eficiencia de la lisis puede evaluarse en esta etapa por microscopia ligera, y si es necesario, puede realizarse la interrupción adicional.</li>
	</ol></li> <li>Traslado el homogeneizado en tubos de 15 mL y completar volumen a 10 mL con tampón hipotónico frío. Fijar el homogeneizado como se describe a continuación antes de proceder con el ratón siguiente.</li>
</ol> 3. Fijación <ol><li>añadir formaldehído a concentración final de 1% y agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir glicina a una concentración final de 0,125 M en cada tubo para detener la fijación y agitar durante 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol> 4. Preparación de núcleos Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Homogenise fijo lisado usar un flojo dounce (5-10 movimientos).
	<ol><li>Transferencia a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para obtener núcleos y ruina celular.</li>
	</ol></li> <li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón hipotónico fresco 5 mL. Filtrar el lisado a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de 50 mL. Volver a filtrar el líquido filtrado a través de un tamiz de 40 μm celular.</li>
	<li>Transferir el filtrado a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos a 4 ° C para obtener el pellet nuclear. 
	Nota: En esta etapa, los núcleos pueden ser sonicados inmediatamente, o el rápido congelado como una pelotilla seca en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Sonicación <ol><li>evaluar el volumen de la pastilla nuclear (alrededor de 50 μL para homogeneización mecánica y dounce) y resuspender en tampón de sonicación hasta 3 a 4 veces del volumen nuclear lleno y someter a ultrasonidos durante 10-15 min a 4 ° C utilizando un sonicador . 
	Nota: La cromatina puede ser analizada inmediatamente como se describe a continuación (6) o congelada y almacenada a -80 ° C.</li>
</ol> 6. Evaluar el tamaño del fragmento de la cromatina tras sonicación Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Para de-reticular, 30 μl de la cromatina en un tubo de ensayo de 1,5 mL y añadir 20 μl 5 M NaCl. El volumen a 500 μl e incubar a 65 ° C durante la noche.
	<ol><li>Al día siguiente, realizar un tratamiento con proteinasa K de 1 μl (stock de 20 mg/mL), 10 μl 2 M Tris pH 6.8 y 10 μl de EDTA de 0,5 M por 1 h a 42 º C. Realice un fenol-cloroformo/cloroformo la extracción y precipitar el ADN con 1 volumen de sodio acetat e (3 M) y 2 volúmenes de etanol al 100% para una h a-80 ° C o durante la noche-20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>De la pelotilla de la DNA por centrifugación a 13.500 x g durante 15 minutos decantar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70% frío y centrifugar nuevamente por 5 min, decantar el sobrenadante y secar el pellet.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en el volumen original (30 μL) de tampón TE. Medir la concentración de ADN en un espectrofotómetro la absorbancia a 260 nm/280 nm. Pipetear 500-1.000 ng de ADN junto con una escala de tamaño de DNA en carriles separados de un gel de agarosa al 1,5% y realizar la electroforesis para determinar el tamaño de fragmento de cromatina. 
	Nota: Tamaño del fragmento debe estar entre 200-500 pares de bases y no debe ser fragmentos de peso molecular perceptible corresponde a no - o mal-fragmentación ADN. Si es necesario, la solución de la cromatina (paso 5) puede volver a sonicada durante más tiempo y entonces volvieron a analizar como se describe anteriormente hasta obtener el tamaño óptimo es.</li>
</ol> 7. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.
<ol><li>Abalorios de sepharose del bloque G de la proteína por tomar 1 mL de la mezcla de 50% en etanol. Pellets de los granos por centrifugación a 400 x g durante 1 min en una sobremesa centrifugar y lavan con 1 mL de la centrifugadora de buffer TE a 400 x g y repetición el Washington
	<ol><li>Después de la segunda centrifugación, resuspender en 1 mL de tampón de dilución de ChIP con 25 μl de BSA (stock 20 mg/mL) y 20 μl de levadura tRNA (stock 10 mg/mL). Bloquear las cuentas de al menos 2 h antes de su uso por rotación (40-60 rpm) a 4 ° C.</li>
		<li>Diluir 50 μg de la cromatina (paso 5) 8 a 10 veces con tampón de dilución de la viruta. Añadir 50 μl de mezcla de grano bloqueado e incubar por 2 h giratoria (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obtener previamente despejado de la cromatina y transferirlo a un tubo nuevo.</li>
	</ol></li> <li>Para la inmunoprecipitación, añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (p. ej., 1-2 μg por 10 μg de cromatina) e incubar durante una noche con giro en 4 ° C. 
	Nota: La cantidad óptima de anticuerpo puede ser recomendada por el proveedor o se puede determinar empíricamente mediante la realización de ChIP-qPCR con diferentes cantidades de anticuerpo hasta enriquecimiento óptima se observa. También sepharose proteína G puede ser reemplazado por proteína A sefarosa según el subtipo de anticuerpo usado.</li>
	<li>Añadir las cuentas bloqueadas al día siguiente e incubar durante 1 h con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g por 20-30 s los granos de la pelotilla, eliminar el sobrenadante, y empezar el ChIP lava.</li>
	<li>ChIP lavados: realice los siguientes lavados con los almacenadores intermediarios: una vez con tampón salino de baja y luego dos veces con tampón salino alto, dos veces con tampón de LiCl y finalmente dos veces con Buffer TE.
	<ol><li>Realizar cada lavado durante 10 min con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C y de la pelotilla de las cuentas entre cada colada por centrifugación a 400 x g por 20-30 s en una centrífuga de mesa.</li>
	</ol></li> <li>La elución, quite el último lavado y resuspender los granos en 250 μl de tampón de elución (recién preparado) por 15 min a temperatura ambiente agitando.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g y recoger el eluido en un tubo nuevo. Realizar este paso dos veces y luego de-reticulación el efluente durante la noche con 20 μl de NaCl 5 M y 1 μl Rnasa A (10 mg/mL), tratamiento con proteinasa K y fenol-cloroformo/cloroformo extractuar como en el paso 6.</li>
	<li>Resuspender en 50 μl de buffer TE y utilizar alícuotas para qPCR ChIP según protocolos estándar 15 para comprobar la calidad de la viruta de.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Aquí describimos un nuevo protocolo para la preparación de cromatina de músculo esquelético de ratón adulto y muestran que esta cromatina es conveniente para los experimentos de ChIP que detectan modificaciones covalentes de la histona y atascamiento del factor de transcripción en los núcleos de la fibra muscular. Este protocolo implica varios pasos críticos. El primero es tejido que se pueden realizar por corte mecánico o dounce. Corte mecánico es más rápido y más reproducible y por lo tanto es el método d...

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se han convertido en los métodos de elección para el estudio de transcripción y regulación epigenética de la expresión génica en distintos tejidos y tipos de la célula1. Esta técnica permite perfiles de genoma de modificaciones covalentes de la cromatina, ocupación variante de la histona y transcripción factor vinculante2,3.
Mientras que realizar ChIP de células cultivadas está bien establecida, ChIP de tejidos mamíferos sigue siendo más difícil. Preparación de cromatina chip implica varios pasos críticos que necesitan ser optimizados para todo tipo de tejidos y células. La cromatina puede ser preparada de los lisados celulares de las células cultivadas o purificación siguiente de sus núcleos. En el caso de tejidos mamíferos, lisis eficiente fijación formaldehído y purificación de núcleos son críticos para asegurar la óptima recuperación de la cromatina. Por otra parte, la elección de fijar los núcleos antes o después de su purificación debe determinarse experimentalmente. A pesar de estos obstáculos, el ChIP se ha realizado con éxito de tejidos como el hígado, testículo, cerebro4,5,6. En el caso del músculo esquelético, la interrupción de un tejido resistente físicamente, que exhibe un alto contenido de proteínas estructurales y el aislamiento de sus núcleos es particularmente desafiante. Dada esta especificidad, protocolos optimizados para otros tejidos no dan resultados satisfactorios para los músculos esqueléticos.
Aquí se describe un protocolo para aislar la cromatina ChIP-grado de tejido de músculo esquelético de ratón que consiste en alterar físicamente el tejido, fijación de formaldehído y el aislamiento de núcleos y sonicación. La eficacia de este método para preparar conveniente para el ChIP de este tejido la cromatina fue demostrada realizando qPCR ChIP y ChIP-seq para varios factores de transcripción, ARN polimerasa II y de modificaciones covalentes de histonas7.
Esta nueva técnica es mucho más rápida que un protocolo previamente divulgados8 que comprende largos pasos de digestión colagenasa durante ese tiempo, cambios en la localización genómica de factores de transcripción y pueden ocurrir alteraciones en la expresión génica. La rapidez con que los núcleos son aislados y fijo hace que el método descrito aquí particularmente atractiva para preparar cromatina que refleja más fielmente el estado nativo ocupación genómica. Por otra parte, aunque tienen otros métodos para la extracción de proteína o aislamiento de cromatina de tejido muscular han sido descrito8,9,10 y utilizado para los experimentos de ChIP-qPCR en genes seleccionados, sin ChIP-seq se ha reportado datos usarlos. El método aquí es conveniente para la transcripción factor e histona modificación ChIP-seq y por lo tanto debe ser también adecuado para 3 / 4C o aplicaciones de captura de conformación de la cromatina de HiC.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m and 40 &amp;mu;m cell strainers (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

Se describe un protocolo eficiente y reproducible para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto, un tejido resistente físicamente con un alto contenido de proteínas estructurales. Disecada extremidades músculos de ratones adultos físicamente se interrumpen por homogeneización mecánica, o una combinación de picado y douncing, en un tampón hipotónico antes de fijación formaldehído de la célula lisada. Los núcleos fijos son purificados por más ciclos de homogeneización mecánica o douncing y filtraciones secuenciales para eliminar restos celulares. Los núcleos purificados pueden ser sonicados inmediatamente o en una etapa posterior después de congelar. La cromatina puede ser sonicada eficientemente y es conveniente para los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina, como lo demuestran los perfiles obtenido para factores de transcripción, ARN polimerasa II y modificaciones covalentes de histonas. Los eventos de enlace detectados con cromatina preparada por este protocolo son predominantemente aquellos que toman lugar en los núcleos de la fibra muscular a pesar de la presencia de cromatina de otro satélite de fibra-asociada y las células endoteliales. Este protocolo, por tanto, se adapta para estudiar la regulación de los genes en el músculo esquelético de ratón adulto.

Para aislar los núcleos, realizamos la homogeneización mecánica del tejido muscular disecado y picada para 15 o 45 s, en 18.000 y 22.000 rpm (véase Tabla de materiales). En todas las condiciones, los núcleos podrían ser separados de los desechos de tejido, pero el rendimiento fue óptimo con la velocidad más baja (figura 1A-B). Núcleos también pueden ser preparados por douncing 3-5 minutos (figur...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K vistas.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

Video: Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Investigación

Genética

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Bioquímica

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Aislamiento de células satélite a partir de músculos de extremidades de ratón y análisis de citometría de flujo

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

Autor destacado: Análisis de cistroma en células madre musculares de ratón 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Biología del Desarrollo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

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Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

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Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón