Unser Ziel ist es, ein organoidbasiertes Modell zu entwickeln und zu charakterisieren, um den Magen-Darm-Trakt nachzuahmen und mit lebenden Schweinen zu vergleichen und uns auf die Transporteigenschaften zu konzentrieren. Der Wechsel von einem klassischen Tierversuch zu. In unserem Bereich der Magen-Darm-Physiologie zu einem.
Organoid-basiertes In-vitro-Modell, das die In-vivo-Situation nachahmt. Wir haben unser Modell des Dünn- und Dickdarms von Organoiden mit kombiniert. Anhand dessen können die Transporteigenschaften in Echtzeit untersucht werden, um einen Vergleich unseres Modells mit der lebenden Schweinesituation zu ermöglichen.
Gerade im Bereich der Nutztierforschung sind alternative Modelle zu den klassischen Tierversuchen selten. Wir überwinden diese Einschränkung, indem wir unser organoidbasiertes Modell des Schweinedarmtrakts verwenden. Wir planen, unser organoidbasiertes Darmmodell zu nutzen, um die Auswirkungen von schweinepathogenen Bakterien zu untersuchen.
Ziel ist es, die Pathogenitätsmechanismen dieser Bakterien zu verstehen. Mischen Sie zunächst die frisch aufgetaute Basalmembran im Verhältnis 1:40 mit eiskaltem sterilem PBS in einem konischen Röhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter dieser Mischung in das apikale Kompartiment jedes Einsatzes innerhalb der sterilen Platten.
Setzen Sie den Deckel der Well-Platte wieder auf und inkubieren Sie mindestens 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation die Lösung vorsichtig ansaugen, ohne die Membran zu berühren. Entferne das Organoid-Medium aus den Vertiefungen, die dreidimensionale Krypten-Organoide enthalten.
Um die Basalmembran aufzulösen, geben Sie einen Milliliter eiskaltes PBS in die Vertiefung und pipettieren Sie mit einer P1000-Spitze auf und ab. Sammeln Sie alle gelösten Organoide in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das mit 10 Millilitern eiskaltem PBS vorgefüllt ist. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 250 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Aspirieren des Überstands wird das Pellet in einem Milliliter warmem 0,05%iger Trypsin-EDTA wieder suspendiert. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad und legen Sie es dann auf Eis, um die Reaktion zu stoppen. Pipettieren Sie mit einer P1000-Spitze 20 Mal auf und ab, um die Organoide gründlich wieder zu suspendieren, und wiederholen Sie dies dann weitere 15 Mal mit einer P1000-Spitze mit einer P200-Spitze obendrauf.
Fügen Sie nun 10 Milliliter eiskaltes DMEM hinzu, das mit 10 % fötalem Kälberserum oder FCS ergänzt wird. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter Monolayer-Medium.
Befolgen Sie in einer Neubauer-Kammer die Anweisungen des Herstellers, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Milliliter zu bestimmen. Ersetzen Sie nun die Beschichtungslösung aus dem apikalen Kompartiment durch 500 Mikroliter des Monolayer-Mediums, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist, und geben Sie drei Milliliter des Monolayer-Mediums in das basale laterale Kompartiment. Entfernen Sie das apikale Monolayer-Medium.
Für die 2D-Kultur geben Sie 500 Mikroliter Monolayer-Medium mit einer angemessenen Menge an Zellen in die apikale Kammer jedes Transwells und inkubieren Sie die Zellen. Für die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands oder der TEAR reinigen Sie die Essstäbchenelektrode mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen. Führen Sie den kurzen Arm der Essstäbchenelektrode in das apikale Kompartiment und den langen Arm in das basale laterale Kompartiment der Einsätze ein.
Schalten Sie als Nächstes ein und lassen Sie die. Äquilibrieren Sie das Messgerät für eine stabile Messung und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Speichern", um die TEAR-Werte aufzuzeichnen. Nachdem Sie die letzte Vertiefung gemessen haben, klicken Sie auf Speichern, um die Daten auf einem USB-Gerät zu speichern.
Reinigen Sie die Elektrode nach jeder Platte und am Ende der Messung. Lassen Sie die Elektrode vor der Lagerung vollständig trocknen. Subtrahieren Sie die vor dem Seeding der Zellen ermittelten leeren TEAR-Werte von den gemessenen zellulären Werten.
Wechseln Sie das Medium und messen Sie den TEAR alle zwei bis drei Tage, um sicherzustellen, dass der TEAR vor dem Wechsel des Mediums gemessen wird. Geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter oder drei Milliliter frisches, warmes Differenzierungsmedium in die apikalen und basalen Kompartimente. Am 18. Tag für Jejunalorganoide oder am neunten Tag für Dickdarmorganoide fahren Sie nach der Aussaat mit funktionellen Experimenten fort.
Schleimhaut- und Serosalpufferlösungen auf 37 Grad Celsius erwärmen und mit Carbogen belüften. Montieren Sie die einzelnen Kammern mit einem leeren Einsatz für jede einzelne Kammer, wobei Sie darauf achten, dass die apikalen Seiten der Stege alle in die gleiche Richtung zeigen. Füllen Sie alle Kammern mit fünf Millilitern vorgewärmter Schleimhautpufferlösung.
Verbinden Sie alle Elektroden von der Spannungszange an die einzelnen Kammern gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Ussing-Kammer-Software zu kalibrieren, klicken Sie auf die Schaltfläche RFDPI in der Spannungsklemmen-Software. Vergewissern Sie sich, dass der Widerstand aller leeren Einsätze etwa 70 Ohm und der Strom etwa null Millivolt beträgt.
Entfernen Sie alle Elektroden und entsorgen Sie die gebrauchte Pufferlösung. Öffnen Sie die einzelnen Kammern, entfernen Sie die leeren Einsätze und halten Sie die Ordnung der Kammern aufrecht. Saugen Sie nun unter dem Sicherheitsschrank vorsichtig das basolaterale und apikale Medium aus der Platte ab.
Waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern warmem Schleimhautpuffer in der apikalen Kammer und mit drei Millilitern Serosalpuffer in der basolateralen Kammer. Entfernen Sie die Einsätze von der Platte und entfernen Sie vorsichtig deren Stützen. Platzieren Sie die Einsätze in den Ussing-Kammern und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung mit der Kalibrierungsphase übereinstimmt.
Nach dem Zusammenbau der einzelnen Kammern füllen Sie die Kammern, die der basolateralen Seite der Zellen zugewandt sind, mit fünf Millilitern Serosalpuffer und die zur apikalen Seite zeigenden Kammern mit fünf Millilitern Schleimhautpuffer. Schließen Sie die Elektroden und Belüftungsrohre an jede einzelne Kammer an und starten Sie die Messung in der Ussing-Software. Ändern Sie die Bedingungen in der Software vom Leerlauf- in den Kurzschlussmodus.
Nach fünf bis 10 Minuten Äquilibrierung geben Sie 10 mikromolare Forskolin in die Serosalkammer. Stoppen Sie nach 15 Minuten die Messung, entfernen Sie die Belüftungsschläuche und Elektroden aus den Kammern und zerlegen Sie die Kammern. Die transepithelialen elektrischen Widerstandswerte stiegen während der Kultivierung progressiv an und erreichten nach 18 Tagen einen Spitzenwert von 150 Ohm mal Zentimeter im Quadrat für Jejunum und 200 Ohm Quadratzentimeter für Dickdarmorganoide nach neun Tagen.
Die basalen Kurzschlussstromwerte waren bei Jejunum-Organoiden signifikant niedriger als bei Dickdarm-Organoiden, während die Basalwiderstandswerte keine signifikanten Unterschiede zeigten. Die Behandlung mit Forskolin erhöhte die basalen Kurzschlussstromwerte bei jejunalen Organoiden signifikant von 0,86 auf 27,78 Mikroampere pro Quadratzentimeter und bei Dickdarmorganoiden von 3,83 auf 28,78 Mikroampere pro Quadratzentimeter.
