J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community&#8217;s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).

1. Herstellung von Polyethylenimin (PEI) als Transfektionsreagenz <ol><li> Man löst etwa 150 mg von PEI in 100 ml H 2 O. </li><li> Einstellen auf pH 7,4 durch Zugabe von HCl, bis die Lösung klar wird und rühre bis zur vollständigen Auflösung. Dieser kann zwischen 10 und 60 Minuten dauern und Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. </li><li> Wenn klar ist, filtern das PEI-Lösung durch ein steriles 0,22 um Filter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank in Aliquots von 5 ml. </li></ol> 2. Herstellung von Lentivirale Partikel Tag 1: <ol><li> Split HEK293T-Zellen zu 60% bis 80% Konfluenz in 162 cm 2 -Kolben oder große Petrischale in Zellinie Kulturmedium (DMEM mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM Glutamin ergänzt Ergänzung). </li></ol> Tag 2: <ol start="2"><li> Bereiten DNA Transfektion Lösung mit 45 ug Gesamt-Plasmid-DNA durch Additionlentiviralen Verpackungsvektoren (7 ug pVSVg; 5 ug pRSV rev; 13 ug pMDL) und 20 ug lentiviralen Plasmid, der das Gen von Interesse oder shRNA von Interesse kodiert. Einzustellen, um ein Volumen von 1 ml mit DMEM. </li><li> Bereiten PEI Transfektion Lösung durch Zugabe von 90 ul 1 mg / ml PEI 930 ul DMEM und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> In DNA-Transfektion Lösung PEI-Lösung. Vortex oder Invertzucker mehrfach und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um DNA-Transfektion Lösung zu erhalten. </li><li> Tropft 2 ml des DNA-Transfektions-Lösung auf die HEK293T Zellen und Inkubation für 4 Stunden in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C. </li><li> Nach 4 Stunden, aktualisieren Sie die Kulturmediums auf PEI zu entfernen. Es ist nicht notwendig, Zellen zu waschen, bevor neues Medium. HINWEIS: PEI ist zytotoxischen und Inkubationszeiten länger als 4 Stunden kann zu Schädigungen der HEK293T-Zellen führen. </li></ol> Tag 4: <ol start="7"><li> Supe ersetzenrnatant mit neuen Kulturmedium. Halten Stand (Virus enthalten); Dies wird in Schritt 2.10 verwendet werden. </li><li> Legen Überstand in 15 ml-Kolben. Um tote Zellen, Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g zu entfernen. </li><li> Schieben Stand durch ein 0,45 um-Filter unter Verwendung einer großen Spritze 60 ml. Speichern Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Tag 5: <ol start="10"><li> Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand; Zentrifuge und Filter, wie in den Schritten 2,8-2,9. </li><li> Pool der Überstände aus den Schritten 2.9 und 2.10 in Ultrazentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50.000 xg in einer Ultrazentrifuge für 90 min. </li><li> Nehmen Sie die Kapseln Ultrazentrifugenröhrchen, die sehr sorgfältig und in eine Sterilbank, die Erinnerung an die Ausrichtung des Rohres in der Zentrifuge. </li><li> Offene Kapselhalteultrazentrifugenröhrchen dekantiert Medium sorgfältig in einer solchen Weise, daß das Pellet an der Oberseite des Rohrs. Da virale Pellets kann schwierig sein, zu visualisieren, zu erinnern, wasSeite des Rohrs ein Pellet gebildet haben. Werfen Sie einen Mikropipette und entfernen letzte bisschen Medium während kümmert sich nicht um die undurchsichtigen braunen Pellets, die auf der Seite der Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen sichtbar zu agitieren. </li><li> Resuspendieren dieses Pellet in 500 ul organoiden Kultur-Medium mit 10 mM Nicotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 und 8 ug / ml Polybren ergänzt. Resuspension in diesem Medium ist wichtig, da mit hohem Titer-Virus wird verwendet, um Organoide direkt transduzieren. </li><li> Optional: einfrieren, das Virus in diesem Medium in zwei Chargen von 250 ul in -80 ° C aliquotiert. </li></ol> 3. Lentivirale Transduktion Organoide Tag 0: <ol><li> Split eine vollständige 0,95 cm 2 und der Organoide zwei Tage vor dem in eine neue und Weiterleitung mit dem Ziel, rund 50 kleine Organoide erhalten. Aufgeteilt Organoiden nach früher veröffentlichten Protokoll 1 (3A, B). </li><li> Ergänzen organoide Kulturmedium mit 10 &amp; mgr; Chir99021 und 10 mM Nicotinamid zystische Hyperproliferations Krypten (3C) zu erhalten. HINWEIS: Cystic Krypten am besten entwickeln, wenn frisch gespalten Organoide werden in Gegenwart von Chir99021 gewachsen. </li></ol> Tag 2: <ol start="3"><li> Ernte Organoide durch Auf- und Abpipettieren der Matrigel und mittlere, wodurch das Gemisch mit einer Mikropipette p1000 zu stören. Legen Sie die Mischung in einem 15-ml-Tube. </li><li> Weiter stören mit Pasteur-Pipette, in dem sich die distale Öffnung hat, durch Schmelzen verringert. Zentrifuge Organoiden für 5 min bei 100 x g pelletieren. HINWEIS: Abhängig von der Größe der Zentrifuge, verwenden Sie ein anderes Zentrifugendrehzahl. Es ist notwendig, die genaue Geschwindigkeit, mit der gestörten Organoide werden aus dem Gemisch abgetrennt finden. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul vorgewärmtes 1x Trypsin (ähnlich wie 0,25% Trypsin). Resuspendieren Organoide in Trypsin und Inkubation3 min in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 3,5 ml Zelllinie Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Glutamin). Zentrifuge 5 min bei 500 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand in Pellet in etwa 20 ul Medium zu verlassen. Übertragen Sie die Organoide in diesem letzten kleinen Menge des Mediums in einen Brunnen auf einem 48-Mulden Platte. </li><li> In hohem Titer Lentivirus in Übertragungsmedium, wie in Schritt 2.14, resuspendieren beschrieben und fahren Sie mit Schritt 3.10. In der Begegnung mit niedrigen Übertragungswirksamkeit, Schritt 3.9 hinzugefügt werden. HINWEIS: Für eine effiziente Weiterleitung, in der Regel fügen Sie ein Aliquot von 250 ul mit hohem Titer Lentivirus um eine Vertiefung Organoide. Dies entspricht 50% der gesamten Ernte Lentivirus aus einer Produktion wie in Schritt 2 dieses Protokolls beschrieben. </li><li> Optional: zu Übertragungswirksamkeit zu verbessern, führen spinoculation, indem Sie die 48 Well-Platte mit Organoide in einem vorgewärmten Zentrifuge auf 326; C und rotieren bei 600 × g für 1 Std. </li><li> Setzen organoide-Virus-Mischung in Kulturbrutschrank und Inkubation für 1 h bei 37 ° C in einem Brutschrank zum Übertragung ermöglichen. </li><li> Optional: zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit der Transduktion inkubieren Organoiden weitere 3 h bei 37 ° C in einem Brutschrank. </li><li> 1 ml der organoiden Kulturmedium und resuspendieren organoide-Virus-Mischung, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 850 xg pelletiert Organoide. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul eiskaltem Matrigel. Da das Material verfestigt, wenn es wärmer wird, verwenden Sie die Pipettenspitzen, die durch Auf- und Abpipettieren eiskaltem PBS für eine Reihe von mal gekühlt werden. </li><li> Setzen des Tröpfchens in der Mitte einer Vertiefung in einer 48 Vertiefungen Inkubieren in Kulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min zu verfestigen. </li><li> Nach 15 Minuten vorsichtig mit 250 ul organoide Kulturmedium, ergänzt10 mM Nicotinamid, 10 uM und 10 uM Chir99021 Y27632. Kleine gestört organoide Fragmente werden in kleine zystische Organoide innerhalb von 24 Stunden zu bilden. </li></ol> Tag 5: <ol start="16"><li> Aktualisieren Medium und zu ergänzen, mit einer Auswahl Antibiotikum (für Puromycin, verwenden Sie 4 ug / ml). </li></ol> 7. Tag: <ol start="17"><li> Ersetzen Medium für Standard organoide Kulturmedium, mit Auswahl Antibiotikum ergänzt. HINWEIS: Angehende wird komplett 2-3 Wochen nach Chir99021 Rückzug sein. Nach der Auswahl können Organoide ohne Selektionsantibiotikum angebaut werden. </li></ol> 4. Organoide RNA Vorbereitung Quantitative RT-PCR oder Microarray- <ol><li> Zur RNA-Präparation, mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Entfernen Sie das Medium aus Organoide und fügen Sie 350 ul Puffer RLT, mit β-Mercaptoethanol ergänzt gerade auf der Kuppel des Matrigel enthält Organoide. Resuspendieren der Material in RLT durch Pipettieren mit p1000 Mikropipette. </li><li> Der weitere RNA prep nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Optional: RNA-Ausbeute zu erhöhen durch Amplifikation mit Ovation Pico WTA Systems und schreibt erste Eingabe von 50 ug Gesamt-RNA nach Herstellerprotokoll. </li><li> Optional: für die Qualitätskontrolle vor der RNA-Microarray, laufen Proben auf einem 2100 Bioanalyzer mit einem Eukaryoten Gesamt-RNA Nano-Chip, mit dem Ziel für eine RNA Integrity Number (RIN) von 8,5 oder mehr (5) nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 5. Die Verarbeitung Organoide für Paraffinausgießstation und Immunhistochemie <ol><li> Vor Beginn der organoiden Einbindung vorwärmen ein Aluminiumblock mit Bohrungen passend Durchmesser 12 mm Glasröhrchen im Brutschrank bei 70 ° C bis Paraffin flüssig zu halten. </li><li> Werfen Sie einen einzigen gut mit ausgewachsenen Organoide und entfernen Sie das Medium, so dass die eingebetteten Organoide intakt. </li><li> 1 mlvon 4% Paraformaldehyd in PBS direkt zu gut und zu beheben bei 4 ° C überall von 1 Stunde über Nacht. </li><li> Para Ersetzen mit 1 ml eiskaltem PBS. Optional: halten fest Organoide in PBS bis zu 1 Woche bei 4 ° C nach diesem Schritt. </li><li> Resuspendieren Fest Organoide in 1 ml PBS aufnehmen und in Glasfläschchen. </li><li> Lassen Organoiden sinken nach unten für 1 min, zu dekantieren und zu ersetzen PBS mit 70% Ethanol in dem ein paar Tropfen von Eosin-Lösung gelöst, um die Visualisierung von Organoiden gesamten Einbettungsprozesses zu ermöglichen. </li><li> Verlassen Organoiden in 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten, entfernen Sie 70% Ethanol durch vorsichtiges Dekantieren, die Möglichkeit, die Organoide von Auge, weil der leichte rosa Farbe Eosin sichtbar zu machen. Ersetzen Sie die Einbettung Lösung mit 96% Ethanol. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.7 wird jedes Mal, Austausch der Einbettung Lösung mit dem nächsten. Pass Organoide durch die folgenden Lösungen anschließend: 70% Ethanol, 90% Ethanol, 96% Ethanol, 100% ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol. </li><li> Dekantiert man die letzten Xylol Wasch und gießen Paraffin in die Röhre. Das Glas sofort in der Pre erwärmt Aluminiumblock bei 70 ° C für 30 min und ersetzen Paraffin mit neuen sauberen Paraffin. </li><li> Gießen Paraffin aus und Pipetten Organoide in den Paraffinblock Form unter Verwendung einer vorgewärmten Pasteur-Pipette mit großer Öffnung. Halten Pasteur-Pipette warmen mit einem Bunsenbrenner. Legen Sie alle Organoide im Paraffinblockform in einer kleinen Schicht von flüssigem Paraffin. </li><li> So viel wie möglich, versuchen Sie, alle Organoide in Richtung der Mitte des Paraffinblocks Form unter Verwendung einer erwärmten Dissektion Nadel manipulieren. Halten Sie Dissektion Nadel warmen mit Bunsenbrenner. </li><li> Wenn Lokalisierung Organoide in der Form ist zufriedenstellend, Kokille leicht auf die Paraffinschicht verfestigt. </li><li> Beenden Sie den Block durch Gießen mehr Paraffin auf und fügen Sie ein Standard-histologische Einbettung Kassette. </li></ol>

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	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents.">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin1,+a+novel+intestinotrophic+mitogen,+ameliorates+experimental+colitis+in+mice.">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids.">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis.">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li><li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer.">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das aktuelle Video-Protokoll beschreibt lentivirale Transduktion Organoide von der Grund Darmepithel und nachgelagerten Analyse dieser Organoide mittels quantitativer RNA-Techniken und Immunhistochemie. Lentivirale Transduktion wird oft in anhaftenden oder schwimmende Zellen in Kulturplatten durchgeführt. Da die dreidimensionale Struktur von Organoiden macht sie schwierig durch virale Partikel eindringen, sind eine Reihe von Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Vorbehandlung der ...

Das Darmepithel ist eine der am schnellsten vermehren Körpergewebe, die verursacht hat es großes Interesse aus der Forschung über Krebs und Stammzellen zu gewinnen. Im Jahr 2009 wurde eine Technik veröffentlicht, um lang anhaltende Kulturen von Klein Darmkrypten in Matrigel erzeugen, Erhaltung eine 3-dimensionale Struktur 1. Diese Strukturen, sogenannte Darm Organoiden, kann unter Verwendung von Standardtechniken gezüchtet werden, mit Umgebungsmedium mit einer Anzahl von definierten Wachstumsfaktoren, einschließlich BMP-Signalweg-Inhibitors Noggin (nOgh) ergänzt, die Wnt-Signalwegs Enhancer rspondin 1 (Rspo1) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) alle eine Darm Proliferation 2-4 verbessern. Organoide übertreffen traditionelle Krebszelllinien in den Aspekten, dass sie nicht-mutierten sind, haben Stammzellen Hierarchie beibehalten, zeigen intakten Zellpolarisation und Ausstellungs Differenzierung in allen Zelllinien in der im Entstehen begriffenen kleine int gefundenestinal Epithel. Da sie transduziert Transgene tragen oder RNA-Interferenz-Konstrukte 5, werden sie verwendet, um spezifische genetische Elemente zu untersuchen, überwiegt Experimenten mit transgenen Mäusen in Facetten Kosten und Geschwindigkeit. Transgene Expression in Organoiden kann unter Verwendung von entweder murine retroviralen oder lentiviralen Vektoren 6,7 werden. Aufgrund der Einschränkungen der murine Retroviren, in der Lage zu transduzieren mitotischen Zellen ausschließlich 8 wird lentiviralen Transduktion häufiger für Zellen, die nur schwer zu infizieren, wie Organoiden verwendet. Viral transduziert und stabil exprimierenden transgenen Organoiden kann für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden, einschließlich quantitative RNA-Analysen und Immunhistochemie. Zusammengenommen hat Kultur Organoide von primären intestinalen Epithelzellen in eine Routine-Technik, die einfach und ohne spezielle Laboranforderungen umzusetzen ist entwickelt, und hat sich die neue Norm in cell Kultur in Forschung auf das Darmepithel. Techniken der virale Transduktion und nachfolgende Downstream-Analyse in Organoide sind mühsam durchzuführen und um organoide Experimente helfen wir generiert dieses Video-Protokoll und zeigt Methoden zur lentivirale Transduktion der kultivierten Organoide. Wir zeigen außerdem, wie die korrekte Verarbeitung Organoide kann die Ausbeute zu erhöhen und damit die Leistung zu verbessern nachgeschalteter Analyse mittels RNA-Techniken oder die Immunhistochemie. In dem Protokoll wurden Organoiden, die von kleinen Darmkrypten abgeleitet werden ausschließlich verwendet, obwohl die beschriebenen Techniken können zum Kolon Organoide als auch angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Polyethylene imine</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-acetyl cysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>mouse Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA system</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>glass vial conical 12&amp;nbsp;mm x 75&amp;nbsp;mm 5&amp;nbsp;ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Yellowish</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Organoide lentivirale Transduktion Die Technik der organoiden Transduktion unter Verwendung lentivirale Partikel hängt von richtigen Umgang mit Organoide vor und während der Weiterleitung. Organoide (3A) wurden kultiviert und sie in einzelne Krypten (3B) gestört wurden. Wie bereits berichtet, diese einzelnen Krypten, wenn sie in Gegenwart der GSK3-Inhibitor Chir99021 kultiviert wurde zystische Krypten 9 (3C). Anschlie?...

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A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Aufrufe.  Academical Medical Center. In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. 

Serie: A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this clinical challenge, tumor xenograft mouse models using long-established human carcinoma cell lines and many transgenic mouse models with tumors have been developed as preclinical models. They partially mimic the features of human carcinomas, but often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies including invasion and metastasis. Thus, alternative models that better represent the malignant progression in human CRC have long been awaited.
We herein show generation of patient-derived tumor xenografts (PDXs) by subcutaneous implantation of small CRC fragments surgically dissected from a patient. The colon PDXs develop and histopathologically resemble the CRC in the patient. However, few spontaneous micrometastases are detectable in conventional cross-sections of affected distant organs in the PDX model. To facilitate the detection of metastatic dissemination into distant organs, we extracted the tumor organoid cells from the colon PDXs in culture and infected them with GFP lentivirus prior to injection into highly immunodeficient NOD/Shi-scid IL2R&#947;null (NOG) mice. Orthotopically injected PDX-derived CRC organoid cells consistently form primary tumors positive for GFP in recipient mice. Moreover, spontaneously developing micrometastatic colonies expressing GFP are notably detected in the lungs of these mice by fluorescence microscopy. Moreover, intrasplenic injection of CRC organoids frequently produces hepatic colonization. Taken together, these findings indicate GFP-labelled PDX-derived CRC organoid cells to be visually detectable during a multistep process termed the invasion-metastasis cascade. The described protocols include the establishment of PDXs of human CRC and 3D culture of the corresponding CRC organoid cells transduced by GFP lentiviral particles.

To allow highly sensitive detection of the disseminating human colorectal cancer (CRC) cells colonizing tissues, we herein show a protocol for efficient transduction of green fluorescent protein (GFP) lentiviral particles into PDX-derived CRC organoid cells prior to their injection into recipient mice, with stereo-fluorescence microscopic observation.

Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Forschung

Krebsforschung

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the increasing use of organoids as a culturing method for primary patient material in the last years, efficient transfer methods of components for genetic engineering in this 3D culture system are in need. Especially for organoids, the efficiency of genetic manipulations depends on a successful transfection. Thus, this protocol was developed to facilitate the electroporation of organoids and to prove its universal functionality in different entities. Human colorectal, pancreatic, hepatic and gastric cancer organoids were successfully electroporated with small and large plasmids in comparison. Based on GFP encoding vectors, the transfection efficiency was determined by FACS. No extensive preparation of the cells or special, cost-intensive electroporation buffers are necessary, and the protocol can be performed within one day.

This protocol describes an efficient electroporation method for the transfection of four different gastrointestinal organoid entities with larger plasmids (to the extent of 10 kB). It can be performed within one day and does not need extensive preparation or special, cost-intensive electroporation buffers.

Universelles und effizientes Elektroporationsprotokoll für die Gentechnik von gastrointestinalen Organoiden

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...

Genetik

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Entwicklungsbiologie

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunologie und Infektion

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived from all sections of the GI tract (gastric, jejunum, duodenum, ileum, colon, rectum) and, upon differentiation, contain most of the cell types that are naturally found in each individual section. For example, intestinal organoids contain nutrient-absorbing enterocytes, secretory cells (Goblet, Paneth, and enteroendocrine), stem cells, as well as all lineage-specific differentiation intermediates (e.g.,&#160;early or immature cell types). The greatest advantage in using gastrointestinal tract-derived organoids to study infectious diseases is the possibility of precisely identifying which cell type is targeted by the enteric pathogen and to address whether the different sections of the gastrointestinal tract and their specific cell types similarly respond to pathogen challenges. Over the past years, gastrointestinal models, as well as organoids from other tissues, have been employed to study viral tropism and the mechanisms of pathogenesis. However, utilizing all the advantages of using organoids when employing highly pathogenic viruses represents a technical challenge and requires strict biosafety considerations. Additionally, as organoids are often grown in three dimensions, the basolateral side of the cells is facing the outside of the organoid while their apical side is facing the inside (lumen) of the organoids. This organization poses a challenge for enteric pathogens as many enteric infections initiate from the apical/luminal side of the cells following ingestion. The following manuscript will provide a comprehensive protocol to prepare human intestinal organoids for infection with enteric pathogens by considering the infection side (apical vs. basolateral) to perform single-cell RNA sequencing to characterize cell-type-specific host/pathogen interactions. This method details the preparation of the organoids as well as the considerations needed to perform this work under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions.

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 BSL-3 Conditions

This protocol describes how to infect human intestinal organoids from either their apical or basolateral side to characterize host/pathogen interactions at the single-cell level using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology.

Anpassung gastrointestinaler Organoide für Pathogeninfektionen und Einzelzellsequenzierung unter Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3)

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Calcium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monoschichten

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der viralen Störung der intestinalen Epithelsignalisierung – Forschungseinblicke und zukünftige Richtungen 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Biologie

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Universelles und effizientes Elektroporationsprotokoll für die Gentechnik von gastrointestinalen Organoiden

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Das

Anpassung gastrointestinaler Organoide für Pathogeninfektionen und Einzelzellsequenzierung unter Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3)

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden