Wir beschreiben die optimale Technik für die intrakranielle Injektion von GEM-abgeleiteten Glioblastomzellen in ein immunkompetentes Mausgehirn, was zu Tumoren führt, die Schlüsselmerkmale des humanen Glioblastoms rekapitulieren. Diese Technik zur orthotopen Injektion von GEM-abgeleiteten TRP-Zellen liefert hochgradig reproduzierbare, skalierbare und konsistente Ergebnisse für Tumore, die ihren Ursprung im Kortex haben, aber die Invasivität von GEM-Tumoren beibehalten. Glioblastom-Hirntumoren der Maus zeigen ein aggressives Wachstum und dringen in das umgebende Hirnparenchym ein.
Daher kann es zur Evaluierung von Therapeutika verwendet werden, die die Tumorinfiltration und -migration bei Patienten unterdrücken können. Dieses Protokoll kann für andere Hirntumormodelle, Viren, Therapeutika angepasst oder für die Injektion in verschiedene Gehirnregionen mit Anpassung der stereotaktischen Koordinaten angepasst werden. Devon Atkinson, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.
Platzieren Sie zunächst Oberflächenprotektoren unter dem stereotaktischen Gerät und auf der Arbeitsfläche. Verbinden Sie den Vinylschlauch des Anästhesiegeräts mit dem Eingang der Gasanästhesieplattform des stereotaktischen Geräts und einen weiteren Schlauch mit seinem Ausgang. Schließen Sie die Digitalanzeige an eine Stromquelle und das Gerät an.
Befestigen Sie als Nächstes die Mikropumpe am Manipulatorarm des Geräts, nachdem Sie die Mikropumpensteuerung an die Stromquelle angeschlossen haben. Stellen Sie die Mikropumpe auf 5,6 Nanoliter pro Sekunde ein. Schließen Sie das Mausheizkissen an den Temperaturregler und an eine Stromquelle an.
Füllen Sie eine 30-Gauge-Präzisionsspritze mit einer Methylmethylcellulose-Zellmischung zurück, indem Sie Blasen vermeiden. Setzen Sie nach dem Einsetzen des Kolbens die Nadel ein und drücken Sie den Kolben, bis die geladene Zellmischung durch die Nadel fällt. Reinigen Sie die Nadel mit einem Zubereitungspad mit 70%igem Alkohol.
Sobald die Präzisionsspritze an der Mikropumpe befestigt ist, drehen Sie den Manipulatorarm vom Tisch weg, bevor Sie die Maus platzieren, um ein Verschieben der Spritzennadel zu verhindern. Übertragen Sie die betäubte Maus auf das stereotaktische Instrument und befestigen Sie sie am Nasenkegel, indem Sie die oberen Zähne auf die Nasenkonusstütze legen. Nachdem Sie den Nasenkegel mit einem Knopf festgezogen haben, kneifen Sie einen Zeh zusammen, um die Reflexe zu überprüfen und eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.
Setzen Sie dann die Ohrbügel ein und ziehen Sie den Knopf fest, um den Kopf zu sichern. Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen unter betäubten Bedingungen zu befeuchten. Injizieren Sie das Analgetikum Buprenorphin SR subkutan und platzieren Sie eine rektale Maussonde, um die Innentemperatur zu überwachen.
Sterilisieren Sie das Operationsfeld mit nach außen gerichteten Kreisen und wechseln Sie dreimal zwischen einem chirurgischen Peeling und Ethanol. Ziehen Sie die straffe Haut mit einer Pinzette ab und machen Sie mit einer Skalpellklinge einen etwa 1 Zentimeter langen Schnitt zwischen den Augen. Für die Zellinjektion geben Sie den Manipulatorarm mit der an der Maus befestigten Spritze zurück.
Nachdem Sie die Noppen festgezogen haben, bewegen Sie die Spritze mit den X- und Y-Noppen in der horizontalen Ebene und montieren Sie sie über dem Bregma. Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf ab, um die Bregma-Position zu bestätigen, und stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null. Bewegen Sie dann die Nadel mit den X- und Y-Knöpfen und der entsprechenden digitalen Anzeige in die gewünschte Position, wie im Manuskript beschrieben, und bewegen Sie die Nadel mit dem Z-Knopf an die Oberfläche des Schädels.
Stechen Sie ein Loch in den Schädel mit einer 1-Milliliter-Spritze und einer angebrachten 25-Gauge-Nadel. Drehen Sie den Manipulatorarm vorsichtig zur Seite, während Sie die Abschrägung der Nadel in Richtung der 30-Gauge-Präzisionsspritze führen. Sobald der Manipulatorarm mit der geladenen Präzisionsspritzennadel über dem Loch positioniert ist, richten Sie die Nadelspitze am Loch aus und senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf in die Dura des Gehirns.
Nachdem Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null gestellt haben, senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf um 1 Millimeter ab und warten Sie eine Minute. Sobald die Tiefe von 2 Millimetern erreicht ist, stoppen Sie die Mikropumpe und stellen Sie sicher, dass die Pumpe stoppt, wenn 2 Mikroliter Zellsuspension injiziert wurden. Um die Nadel aus dem Schädel zu entfernen, heben Sie sie um einen Millimeter an und warten Sie eine Minute.
Nehmen Sie zum Wundverschluss mit dem hölzernen Ende eines Applikators mit Wattespitze ein Stück Knochenwachs und formen Sie es zu einem Kegel. Nachdem Sie das Wachs in die Öffnung im Schädel gegeben haben, schieben Sie es in das Loch. Verwenden Sie die perlensterilisierte Pinzette, um das restliche Wachs auf dem Schädel zu schmelzen.
Sobald es glatt wird, geben Sie zwei Tropfen betäubende Bupivacain-Lösung in den Einschnitt und ziehen Sie die Hautränder mit einer Pinzette zusammen. Nachdem Sie die Haut mit einem oder zwei Wundklammern strafft haben, schließen Sie die Haut, legen Sie die Maus in einen sauberen Auffangkäfig auf einem Heizkissen in einem zugfreien Bereich und beobachten Sie die Maus genau. Wöchentliche MRT-Scans zeigten eine zunehmende Tumorlast im Gehirn und Tumorvolumenmessungen.
Die MRT-Tumorvolumenmessung ergab auch nach der Bestrahlung keine Unterdrückung des Tumorwachstums und das Überleben der behandelten Mäuse war nicht erhöht. Die GBM-Tumoren in syngenen Modellen schienen aggressiv gewachsen zu sein und durchbrachen den Schädel am terminalen Endpunkt. Wenn in der Bildgebung nach der Zellimplantation ein extrakranielles Wachstum beobachtet wird, deutet dies auf eine Zellleckage während des Injektionsprozesses hin, und beim Herausziehen der Injektionsnadel ist mehr Vorsicht geboten.
Die Histopathologie von orthotopen TRP-GBM-Tumoren bestätigte das Vorliegen eines Astrozytoms Grad 4, einschließlich der Rekapitulation der charakteristischen Merkmale bei Tumoren wie Pseudopalisading und Nekrose. Seien Sie präzise, wenn Sie den Nullpunkt bei bregma einstellen, um sicherzustellen, dass die Zellinjektionskoordinaten korrekt sind. Das Absenken und Anheben der Nadel im Gehirn muss langsam erfolgen, um Trauma und Rückfluss zu vermeiden.
Nach der Injektion von Tumorzellen können wöchentliche MRT-Scans verwendet werden, um die Ausgangsgröße des Tumors vor Beginn der Behandlung zu bestimmen und die sich ändernde Tumorlast im Gehirn sichtbar zu machen.
