Nous décrivons la technique optimale pour l’injection intracrânienne de cellules de glioblastome dérivées de GEM dans un cerveau de souris immunocompétent, ce qui entraîne des tumeurs qui récapitulent les principales caractéristiques du glioblastome humain. Cette technique d’injection orthotopique de cellules TRP dérivées de GEM donne des résultats hautement reproductibles, évolutifs et cohérents pour les tumeurs qui proviennent du cortex, tout en maintenant le caractère invasif des tumeurs GEM. Les tumeurs cérébrales du glioblastome chez la souris affichent une croissance agressive et envahissent le parenchyme cérébral environnant.
Par conséquent, il peut être utilisé pour évaluer les thérapies qui peuvent supprimer l’infiltration tumorale et la migration chez les patients. Ce protocole peut être personnalisé pour d’autres modèles de tumeurs cérébrales, virus, thérapeutiques ou adapté pour l’injection dans différentes régions du cerveau avec les ajustements des coordonnées stéréotaxiques. Devon Atkinson, un associé de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, placez des protecteurs de surface sous l’appareil stéréotaxique et sur la surface de travail. Connectez le tube en vinyle de la machine d’anesthésie à l’orifice de la plate-forme d’anesthésie gazeuse de l’appareil stéréotaxique et un autre tube à son port de sortie. Connectez l’écran numérique à une source d’alimentation et à l’appareil.
Ensuite, fixez la micro-pompe au bras manipulateur de l’appareil après avoir connecté le contrôleur de micro-pompe à la source d’alimentation. Réglez la micropompe à 5,6 nanolitres par seconde. Connectez le coussin chauffant de la souris au régulateur de température et à une source d’alimentation.
Charger à contre-charge une seringue de précision de calibre 30 avec un mélange de cellules de méthylméthylcellulose en évitant les bulles. Après avoir inséré le piston, fixez l’aiguille et appuyez sur le piston jusqu’à ce que le mélange de cellules chargées tombe à travers l’aiguille. Nettoyez l’aiguille avec un tampon de préparation d’alcool à 70%.
Une fois la seringue de précision fixée à la micropompe, faites pivoter le bras manipulateur loin de la scène avant de placer la souris pour éviter le déplacement de l’aiguille de la seringue. Transférez la souris anesthésiée à l’instrument stéréotaxique et fixez-la au cône nasal en plaçant les dents supérieures sur le support du cône nasal. Après avoir serré le cône nasal avec un bouton, pincez un orteil pour vérifier les réflexes afin d’assurer une anesthésie adéquate.
Insérez ensuite les barres d’oreille et serrez le bouton pour fixer la tête. Appliquez une pommade pour les yeux pour lubrifier les yeux dans des conditions anesthésiées. Injectez l’analgésique buprénorphine SR par voie sous-cutanée et placez une sonde rectale de souris pour surveiller la température interne.
Stériliser le champ chirurgical à l’aide de cercles extérieurs, en alternant trois fois entre un gommage chirurgical et de l’éthanol. Tirez la peau tendue avec une pince et utilisez une lame de scalpel pour faire une incision d’environ 1 centimètre de long entre les yeux. Pour l’injection cellulaire, retournez le bras manipulateur avec la seringue attachée à la souris.
Après avoir serré les boutons, déplacez la seringue à l’aide des boutons X et Y dans le plan horizontal et montez-la sur le bregma. Abaissez l’aiguille, à l’aide du bouton Z, pour confirmer la position du bregma et réglez la console de lecture numérique à zéro. Ensuite, déplacez l’aiguille dans la position souhaitée, comme décrit dans le manuscrit, en utilisant les boutons X et Y et la lecture numérique correspondante, et utilisez le bouton Z pour déplacer l’aiguille à la surface du crâne.
Percez un trou dans le crâne à l’aide d’une seringue de 1 millilitre avec une aiguille de calibre 25 attachée. Faites pivoter délicatement le bras manipulateur sur le côté, tout en plaçant le biseau de l’aiguille vers la seringue de précision de calibre 30. Une fois que le bras manipulateur avec l’aiguille de seringue de précision chargée est positionné sur le trou, alignez l’extrémité de l’aiguille avec le trou et utilisez le bouton Z pour abaisser l’aiguille dans la dure-mère du cerveau.
Après avoir mis la console de lecture numérique à zéro, abaissez l’aiguille de 1 millimètre avec le bouton Z et attendez une minute. Une fois la profondeur de 2 millimètres atteinte, arrêtez la micropompe et assurez-vous que la pompe s’arrête lorsque 2 microlitres de suspension cellulaire ont été injectés. Pour retirer l’aiguille du crâne, soulevez-la d’un millimètre et attendez une minute.
Pour la fermeture de la plaie, à l’aide de l’extrémité en bois d’un applicateur à pointe de coton, prenez un morceau de cire d’os et façonnez-le en cône. Après avoir placé la cire dans l’ouverture du crâne, poussez-la dans le trou. Utilisez la pince stérilisée par perles pour faire fondre la cire restante sur le crâne.
Une fois qu’il devient lisse, ajoutez deux gouttes de solution anesthésique de bupivacaïne dans l’incision et tirez les bords de la peau ensemble, à l’aide de forceps. Après avoir tiré la peau tendue, à l’aide d’un ou deux clips de plaie, fermez la peau, placez la souris dans une cage de récupération propre sur un coussin chauffant dans une zone sans courant d’air et observez attentivement la souris. Les IRM hebdomadaires ont montré une augmentation de la charge tumorale dans le cerveau et des mesures du volume tumoral.
La mesure du volume tumoral par IRM a révélé un manque de suppression de la croissance tumorale, même après la radiothérapie, et la survie des souris traitées n’a pas été augmentée. Les tumeurs GBM dans les modèles syngéniques semblaient être cultivées agressivement et ont percé le crâne par le point final terminal. Si une croissance extracrânienne est observée à l’imagerie après l’implantation cellulaire, cela indique une fuite cellulaire pendant le processus d’injection, et plus de précautions doivent être prises lors du retrait de l’aiguille d’injection.
L’histopathologie des tumeurs orthotopiques TRP GBM a confirmé la présence d’astrocytome de grade 4, y compris la récapitulation des caractéristiques distinctives des tumeurs telles que la pseudopalissade et la nécrose. Soyez précis lorsque vous réglez le point zéro au niveau du bregma pour garantir des coordonnées d’injection cellulaire correctes. L’abaissement et le relèvement de l’aiguille dans le cerveau doivent être lents pour prévenir les traumatismes et les reflux.
Après l’injection de cellules tumorales, des IRM hebdomadaires peuvent être utilisées pour déterminer la taille de la tumeur de base avant de commencer le traitement et pour visualiser l’évolution de la charge tumorale dans le cerveau.
