Wir sind uns besonders bei Patienten am Vanderbilt University Medical Center zu zu sehr gedankt, die unschätzbares Forschungsmaterial für die Molecular Neurosurgical Tissue Bank zur Verfügung gestellt haben. Wir danken allen, die die Tissue Bank gegründet und unterhalten haben, Reid C. Thompson MD (Hauptermittler), Cherryl Kinnard RN (Forschungsschwester) und Larry A. Pierce MS (Manager). Histologische Dienstleistungen wurden teilweise vom Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Translational Pathology Shared Resource (unterstützt durch die Auszeichnung 5P30 CA068485 an das Vanderbilt-Ingram Cancer Center) durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an MKC aus dem NINDS (1R21NS070139), dem Burroughs Wellcome Fund und den VMC-Entwicklungsfonds unterstützt. MKC wird durch das Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development durch Stipendium 1 I01 BX000744-01 unterstützt. Der Inhalt gibt nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder der Regierung der Vereinigten Staaten wieder.

1. Vorbereitung der Tumorzellsuspension
Hinweis: Für die Herstellung und Aufrechterhaltung von primären orthotopischen Gliom-Xenografts sind geeignete institutionelle Genehmigungen für die Verwendung von Patientenmaterial und Tieren erforderlich. Am Vanderbilt University Medical Center wird resektiertes Tumormaterial, das über dem für diagnostische Zwecke erforderlichen Material hinausgeht, mit Zustimmung des Patienten für ein Forschungsgewebe-Repository gesammelt. Die Proben werden mit einer randomisierten 5-stelligen REDcap-Datenbanknummer beschriftet, und alle patientenspezifischen Bezeichner werden entfernt. Die REDcap-Datenbank enthält deidentifizierte klinische Daten für jede Probe im Gewebe-Repository, die Geschlecht, Alter (in Jahren), Rasse, Überlebensstatus, Pathologie, Krebsbehandlungen, Jahr der Resektion und Zeit bis zum Fortschreiten umfasst. Um die Sterilität zu erhalten und den Erfolg der primären Xenograft-Methode zu optimieren, sollten alle Reagenzien, dampfautoklavierten chirurgischen Instrumente und die chirurgische Stelle im Voraus montiert oder vorbereitet werden.
Hinweis: Gliom-Proben enthalten oft große Mengen myelin und Schmutz. Je nach Probengröße kann es notwendig sein, mehr als 4 diskontinuierliche Gradientenrohre für eine angemessene Entfernung von Myelin und Schmutz zu verwenden.
Hinweis: Der Prozess wird abgeschlossen, wenn kein oder wenig, deutlich sichtbares undissoziiertes Gewebe übrig ist. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen während des Triturierungsprozesses.
Hinweis: Die Zelllebensfähigkeit nach Dissoziation beträgt in der Regel >90 %. Geringere Viabilitäten können viele Variablen widerspiegeln, einschließlich suboptimaler Gewebehandhabung oder Transportzeit aus dem Operationssaal, Kryokonservierungsmethode oder Papain-Dissoziationstechnik. Niedrigere zelluläre Viabilitäten können jedoch noch ausreichen, solange eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Mittel in dem entsprechenden Volumen transplantiert werden kann. Für jede Maus werden 50.000-200.000 lebensfähige Zellen implantiert. Aufgrund der abgeschrägten Spitze der Spritzennadel sollte im Endvolumen eine zusätzliche Zellsuspension von 5 l enthalten sein, um sicherzustellen, dass für jede Injektion ausreichend Material in die Spritze eingezogen werden kann. Um z. B. für 5 Mäuse 2 l/Maus zu injizieren, sollte das Endvolumen 15 l (15 l = (5 x 2 l) + 5 l) betragen.
<ol><li>Frisch resektiertes, identifiziertes Patientenmaterial in einen sterilen, verschlossenen Behälter auf Eis legen, um es zum Labor zu transportieren. Verarbeiten Sie die Probe direkt zur Transplantation oder kryokonservieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff (siehe unten) zur Lagerung in flüssigem Stickstoff und später zur Verwendung.</li>
	<li>Bereiten Sie die Papain-Dissoziationslösungen (Papainlösung, Wasch-/Protease-Inhibitor-Lösung und diskontinuierliche Gradientenlösung) in einer sterilen Haube mit den vom Hersteller gelieferten Kit-Komponenten und Anweisungen vor. Beschriften Sie sterile 15 ml Polystyrol-Konikonröhrchen und verteilen Sie die Lösungen wie folgt:<ul>
<li>Tube 1: 5 ml Papainlösung</li>
			<li>Tube 2: 3 ml Wasch-/Protease-Inhibitorlösung</li>
			<li>Tuben 3-6: je 5 ml diskontinuierliche Gradientenlösung</li>
		</ul>
</li>
	<li>Die Gliomprobe mit 5 ml Papainlösung in Tube 1 geben und mit einer 5 ml Pipette über einen Zeitraum von 10-20 min triturat.</li>
	<li>Das Material 10 Mal nach oben und unten pfeifen und dann das Material für 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren, bevor der nächste Zyklus der Trituration in Gang gesetzt wird.</li>
	<li>Positionieren Sie die Spitze der 5 ml Pipette näher an der Unterseite des konischen Rohres mit jedem Triturationszyklus, so dass die Spitze den Boden des Rohres für die letzten 2 Zyklen berührt.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und Pipette das Pellet nach oben und unten 10x in 3 ml der Wasch-/Protease-Inhibitor-Lösung.</li>
	<li>Schichtung eines gleichen Volumens der Suspension über jede der 5 ml diskontinuierlichen Gradientenlösungen (Rohre 3-6), wobei eine Pipettentur auf die "Gravity"-Dosiergeschwindigkeit eingestellt ist.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre in eine Zentrifuge, die mit einem Schwenkschaufelrotor ausgestattet ist, wobei die Beschleunigungsgeschwindigkeit auf die niedrigste Einstellung reduziert und die Bremse ausgeschaltet ist. Zentrifuge bei 76 x g für 12 min bei Raumtemperatur. Wenn die Bremse ausgeschaltet ist, wird die Zentrifugation in der Regel nach 20 min abgeschlossen.</li>
	<li>Den Überstand entfernen, wieder aufhängen und in 5 ml steriler, ausgewogener Salzlösung kombinieren und die Zellen auf Eis legen.</li>
	<li>Entfernen Sie einen Teil (10-100 l) der Zellsuspension und bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen durch Trypan-Blauausschluss mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit einer Dichte von 25.000-125.000 lebensfähigen Zellen pro l wieder aus.</li>
	<li>Übertragen Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension auf ein 200-l-Mikrozentrifugenrohr (PCR-Rohr) und legen Sie es auf Eis.</li>
</ol>2. Vorbereitung der chirurgischen Stelle und Instrumente
Hinweis: Während des Eingriffs werden sterile chirurgische Handschuhe getragen. Je nach Bedarf der einzelnen Institutionen können OP-Kleider, Mützen und Gesichtsschutz erforderlich sein.
<ol><li>Bereiten Sie eine desinfizierte Tischplatte für die Nagetierchirurgie mit getrennten angrenzenden Bereichen für die Tieraufbereitung, Das Betriebsfeld und die Tierregeneration vor.</li>
	<li>Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente in einem Dampfautoklaven. Anschließend verwenden Sie einen heißen Perlensterilisator, um Instrumente zu blitzsterilisieren, wenn Sie von einem Tier zum anderen wechseln.</li>
</ol>3. Induktion, Anästhesie und Analgesie
Hinweis: Operationen, die mehr als 15 min ab dem Zeitpunkt der Anästhesie der Mäuse sind, erfordern eine Kontaktwärmequelle. Um Unterkühlung zu vermeiden, werden die Mäuse während der prä- und postoperativen Perioden mit einer Wärmequelle (zirkulierende Warmwasserdecke) versorgt. 
<ol><li>Ketamin/Xylazin-Cocktail zur Induktionsanästhesie so zubereiten, dass jede Maus Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg erhält, indem sie 10 l des Cocktails pro Gramm Körpergewicht injiziert.</li>
	<li>
Tabelle 1. Anästhesie-Cocktail.
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">Lagerkonzentration</td>
					<td colspan="3">Volumen zur Vorbereitung </td>
				</tr>
<tr>
<td>eine Maus</td>
					<td>fünf Mäuse</td>
					<td>zehn Mäuse</td>
				</tr>
<tr>
<td>Ketamin</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 l</td>
					<td>125 l</td>
					<td>250 l</td>
				</tr>
<tr>
<td>Xylazin</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2,5 l</td>
					<td>12,5 l</td>
					<td>25 l</td>
				</tr>
<tr>
<td>Isotonische Saline</td>
					<td></td>
					<td>223 l</td>
					<td>1.113 l</td>
					<td>2.225 l</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">gesamt</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1.250 l</td>
					<td>2.500 l</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Bereiten Sie Ketoprofen-Lösung für Analgesie vor, indem Sie die Stammlösung (10 mg/ml) 1:20 in sterilem, pyogenfreiem Wasser verdünnen, so dass jede Maus eine Dosis von 5 mg/kg erhält, indem sie 10 l der Lösung pro Gramm Körpergewicht injiziert.</li>
	<li>Wiegen und aufzeichnen Sie das prächirurgische Gewicht. Die einzelnen Mausgewichte variieren, reichen aber in der Regel von 18-22 g.</li>
	<li>Mit einer Insulinspritze in den intraperitonealen Raum injizieren Sie 10 l des Ketamin/Xylazin-Cocktails pro Gramm Mauskörpergewicht. Injizieren Sie z. B. 200 l für eine 20 g Maus.</li>
	<li>Bestimmen Sie, ob die Maus vollständig durch Zehenkneifen des Hinterbeins beeinflicht ist. Es dauert in der Regel 3-5 min für die Maus nicht mehr von der Prise zurückziehen.</li>
	<li>Mit einer Insulinspritze in die lockere Haut der Flanke injizieren Sie 10 l der Ketoprofenlösung pro Gramm Mauskörpergewicht subkutan. Injizieren Sie z. B. 200 l für eine 20 g Maus.</li>
	<li>Rasieren Sie Haare mit Clippers über den Schädel, schrubben Sie die freiliegende Kopfhaut mit Povidon-Jod mit einem Baumwoll-Spitzenapplikator und wischen Sie dann ein Alkoholpad ab. Wiederholen Sie diese Schritte, Povidon-Jod-Peeling und Alkohol wischen, zwei weitere Male.</li>
	<li>Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf.</li>
	<li>Machen Sie einen 1 cm Mittellinienschnitt, der sich von hinter den Ohren bis direkt vor den Augen mit einer sterilen Skalpellklinge erstreckt.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus unter einem sezierenden Bereich und setzen Sie den Schädel aus, um die Nahtlinien zu identifizieren. Mit kreisförmigen Bewegungen mit einem Bohrer, zentrieren Sie ein Gratloch 2,5 mm seitlich zum Bregma und 1 mm hinter der koronalen Naht.</li>
</ol>4. Intrakranielle Transplantation
Hinweis: Injektionsvolumina von mehr als 2,5 l können für Mäuse tödlich sein.
<ol><li>Positionieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die oberen Schneidezähne über die Schneidezähne hängen und die Nasenklemme so auftragen, dass der Schädel fest in einer neutralen Position gehalten wird.</li>
	<li>Ziehen Sie 5-10 l der Zellen in einem Mikrozentrifugenrohr mehrmals nach oben und unten in eine 10-l-Hamilton-Spritze, die im Sondenhalter des stereotaktischen Manipulators eingeklemmt ist, um die Suspension zu mischen und Blasen zu beseitigen. Drücken Sie den Kolben, so dass die Spritze mit 2 l (das ausreichende Volumen, um ein Tier zu injizieren) geladen wird.</li>
	<li>Ziehen Sie den seitlichen Rand des Hautschnitts, um das Gratloch freizulegen, und führen Sie mit dem Mikromanipulator die Nadel in das Gratloch ein, so dass sich der abgeschrägte Teil direkt unter der Schädeloberfläche befindet.<ol>
<li>Bewegen Sie die Nadel 3 mm und ziehen Sie dann die Nadel 0,5 mm, um einen Platz für die Injektion zu schaffen.</li>
			<li>Bewegen Sie den Kolben langsam über 30 Sek. und lassen Sie dann die Nadel im Gehirn für weitere 2 min bleiben. Ziehen Sie die Nadel nach und nach ab, indem Sie 0,5 mm aufsteigen und auf weitere 30 Sek. warten, bevor Sie die Nadel aus dem Gehirn entfernen.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und schließen Sie die Wunde mit einem Autoclip.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf ein wärmendes Pad, um die Körpertemperatur zu halten und kontinuierlich das Atmungsmuster und die Farbe von Schleimhäuten und freiliegenden Geweben (Fußsohlen) zu überwachen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in einen sterilen Mikroisolatorkäfig, sobald sie sich vollständig von der Anästhesie (sternal und ambulant) erholt, und bringen Sie sie in die Tierhaltungseinrichtung zurück.</li>
</ol>5. Tierpflege und -beobachtung nach der Implantation
Hinweis: Die zuverlässigste Indikation für Tumorengraftment und infiltratives Wachstum ist allmählich, anhaltende Gewichtsverlust begleitet von der Entwicklung der geknickten Haltung und rauen Haarmantel. In seltenen Fällen, neurologische Defizite festgestellt werden, die Ataxie, Parese, und Krampfanfälle gehören. Orthotopische primäre Xenografts sind hochinvasiv und entwickeln sich über einen langen Zeitraum. Mäuse manifestieren in der Regel Symptome des Tumorwachstums 3-6 Monate nach der Transplantation.
<ol><li>Beobachten Sie Mäuse mit orthotopischen Xenografts täglich für Nahrung und Wasseraufnahme, Verhalten, Pflege und Anzeichen einer Infektion an der Einschnittstelle.</li>
	<li>Ketoprofen (5 mg/kg subkutan, 1-2x pro Tag) verabreichen, wenn Schmerzen oder Leiden postoperativ beobachtet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie Autoclips 8-10 Tage nach der Operation.</li>
	<li>Wiegen Sie Mäuse wöchentlich.</li>
	<li>Überwachen Sie Anzeichen und Symptome einer Tumorenpfropte.</li>
</ol>6. Tumorernte
Hinweis: Bei dieser Methode enthält die erste koronale Scheibe (#1) den hinteren Aspekt der Olfaktorzwiebeln und den vorderen Aspekt der Frontallappen. Der transplantierte Tumor ist am häufigsten in der rechten Hemisphäre der folgenden 3 koronalen Scheiben (Scheibe #2, #3 und #4) und der Injektionsblick ist routinemäßig in koronalen Scheiben #3 enthalten. Je nach experimentellem Bedarf kann das Material für Tumorpassagen, gefrorene Gewebeabschnitte, formalin fixierte Paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte, Durchflusszytometrie von dissoziiertem Gewebe, Zellkultur oder Lysate für dna-, RNA- oder Proteinanalysen verwendet werden. Teile des Tumors können für zukünftige Bedürfnisse mit Zelllebensfähigkeit von 80-95% kryokonserviert werden.
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse durch längere Exposition gegenüber Kohlendioxid, gefolgt von zervikalen Dislokationen.</li>
	<li>Enthaupten Sie eingeschläferte Mäuse an der Basis des Gehirns (foramen magnum-Ebene) mit einer größeren chirurgischen Schere, und ziehen Sie die Haut aus dem Schnitt nach vorne, um den Schädel vollständig freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn.<ol>
<li>Legen Sie eine Spitze der feinen chirurgischen Schere in den seitlichen Aspekt des Foramen magnum, um Ebene der linken externen Auditfleisch, um den okzipitalen Knochen entlang der linken Seite des Schädels zu schneiden. Führen Sie den gleichen Schnitt auf der rechten Seite durch.</li>
			<li>Schneiden Sie den okzipitalen Knochen entlang einer koronalen Ebene von einem externen auditiven Fleisch auf den anderen und entfernen Sie den Knochen, um das Kleinhirn freizulegen.</li>
			<li>Schneiden Sie die Nasenknochenplatten zwischen den Augen.</li>
			<li>Schneiden Sie die sagittale Naht, indem Sie hinter der sagittalen Naht von den Nasenknochenplatten bis zum Bregma schneiden. Vervollständigen Sie den Mittellinienschnitt entlang der sagittalen Naht, indem Sie vordergründ vom Lambda zum Bregma schneiden.</li>
			<li>Legen Sie vorsichtig die Spitze eines feinen Zangenpaares entlang der sagittalen Öffnung auf jeder Seite ein, um jede durale Haftung des Schädels an das Gehirn zu reißen und dann die beiden Schädelhälften seitlich zu schälen, um das Gehirn und die olfaktorischen Glühbirnen dorsal freizulegen.</li>
			<li>Schieben Sie die Zange zwischen dem ventralen Aspekt der olfaktorischen Glühbirnen und dem Schädel, um jegliche Adhäsionen zu befreien.</li>
			<li>Neigen Sie den Schädel zurück, damit das Gehirn zurückgezogen werden kann, so dass die Optik und andere Hirnnerven freigelegt werden. Trennen Sie die Hirnnerven, um das Gehirn in eine Schüssel mit sterilem PBS zu entlassen.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn mit einem Wägespachtel auf einen Matrixschneider und erzeugen Sie 2 mm koronale Scheiben mit Rasierklingen.</li>
	<li>Die koronalen Scheiben in einer Schale mit sterilem PBS für die weitere Sichtprüfung und weitere Gewebeverarbeitung anrichten.</li>
</ol>7. Tumor-Kryokonservierung
<ol><li>Bereiten Sie eine Lagerlösung von Kryokonservierungsmedium vor.<ol>
<li>Fügen Sie 50 ml Proliferationsergänzung, 5 ml 100x Penicillin und Streptomycin-Lösung und 450 l 0,2% Heparin zu 450 ml Basalmedium hinzu.</li>
			<li>Lagerhaltung stämmieren Sie die Lagerlösung bei 4 °C, die vor Licht geschützt ist.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine funktionierende Lösung des Kryokonservierungsmediums vor.<ol>
<li>Kombinieren Sie 47,5 ml Kryokonservierungsmedium und 2,5 ml steriles DMSO in einem 50 ml Polypropylen-Konustube und mischen Sie gut.</li>
			<li>Aliquot 1,0 ml Arbeitslösung für jeden Kryovial und lagern bei 4 °C vor Licht geschützt.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Legen Sie eine 2 mm koronale Scheibe des xenotransplantierten Gehirns in ein Kryovial, das Kryokonservierungsmedium enthält, auf Eis.</li>
	<li>Die Durchstechflasche fest verschließen und bei -80 °C in einen Gefrierbehälter geben. Übertragen Sie den Kryovial am nächsten Tag in einen flüssigen Stickstofftank für eine längere Lagerung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials.">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. 84, 1424-1431 (2001).</li><li>Witt Hamer, D. e., C, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+profile+of+human+malignant+glioma+is+altered+early+in+primary+cell+culture+and+preserved+in+spheroids.">The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids.</a> Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+in+vivo+and+in+vitro+fates+of+glioblastoma+cell+subpopulations+with+amplified+EGFR.">Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR.</a> Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).</li><li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro.">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).</li><li>Piaskowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+cells+showing+IDH1+mutation+cannot+be+propagated+in+standard+cell+culture+conditions.">Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. 6, 425-436 (2006).</li><li>Sasai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+pathway+activity+is+down-regulated+in+cultured+medulloblastoma+cells:+implications+for+preclinical+studies.">Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies.</a> Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).</li><li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+orthotopic+transplantation+of+fresh+surgical+specimen+preserves+CD133++tumor+cells+in+clinically+relevant+mouse+models+of+medulloblastoma+and+glioma.">Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma.</a> Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).</li><li>Suggitt, M., Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+preclinical+anticancer+drug+screening:+empirical+to+target-driven+approaches.">50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches.</a> Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans:+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved.">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).</li><li>Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-directed+therapies:+recent+data+from+the+laboratory+and+clinic.">Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic.</a> Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).</li><li>Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+in+vitro+and+in+vivo+applications+of+primary+human+glioblastoma+multiforme+(GBM)+xenograft+models+for+translational+biology+studies+and+drug+discovery.">Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).</li><li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice:+new+tools+to+tackle+old+problems.">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59, 1155-1168 (2011).</li><li>Sarangi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inhibition+of+the+Hedgehog+pathway+in+established+malignant+glioma+xenografts+enhances+survival.">Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival.</a> Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).</li><li>Valadez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Hedgehog+pathway+responsive+glioblastomas+by+isocitrate+dehydrogenase+mutation.">Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation.</a> Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).</li><li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma.">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).</li><li>Ehtesham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-dependent+activation+of+the+hedgehog+pathway+in+glioma+progenitor+cells.">Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells.</a> Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).</li><li>Kelly, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglioma+cell+lines+containing+t(1;19)(q10;p10.">Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10.</a> Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).</li><li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells.">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li><li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD/LtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells.">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Kultivierte Zelllinien, Xenografts und gentechnisch veränderte Mäuse sind die gebräuchlichsten Methoden zur Modellierung von Gliomen, und es gibt deutliche Vorteile und Einschränkungen für jedes Modellsystem3,13,14. Relevante Vorteile von primären orthotopischen Gliom-Xeografts sind infiltratives Wachstum, das diffuse Gliome typisiert, und die Retention genetischer Veränderungen und wichtige Signalmechanismen, die in kultivierten Gliomzellen äußerst schwierig zu erhalten sein können. Zum Beispiel kö...

Bösartige Gliome sind primäre Gliatumoren des zentralen Nervensystems, die im Gehirn und gelegentlich im Rückenmark auftreten. Gliome werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) nach histologischer Ähnlichkeit mit Astrozyten, Oligodendrozyten oder ependymalen Zellen klassifiziert und dann numerisch (I bis IV) für pathologische Merkmale der Malignität eingestuft. Die häufigsten histologischen Subtypen sind Astrozytome, Oligodendrogliome und gemischte Oligoastrozytome. Bösartige Gliome, die die KLASSEN II bis IV der WHO umfassen, zeichnen sich durch invasives Wachstum und Widerspenstigkeit gegenüber aktuellen Therapien aus. Jedes Jahr wird in den Vereinigten Staaten etwa 15.750 Personen mit einem bösartigen Gliom diagnostiziert und schätzungsweise 12.740 Patienten erliegen dieser Krankheit. Diese Statistiken unterstreichen die besonders tödliche Natur bösartiger Gliome und den wichtigen Bedarf an verbesserter therapeutischer Wirksamkeit.
Krebsmodelle sind für die Untersuchung der Tumorbiologie und -therapien unerlässlich. Menschliche Krebszelllinien stellen einen wichtigen ersten Schritt für In-vitro-Manipulationen und in vivo Xenografting-Studien (sekundäre Xenografts)1dar. Jedoch, Standard-Krebszellkulturen unterziehen phänotypische und genotypische Transformation2-4, die nicht in sekundären Xenografts wiederhergestellt werden kann5. Darüber hinaus können genetische Veränderungen wie Isocitrate-Dehydrogenase (IDH)Mutationen6, unterschiedliche Stammzellpopulationen7 und Abhängigkeit von wichtigen Signalwegen8 in Krebszellkulturen verloren gehen. Genomprofile können in der Krebssphärenkultur in besserem Maße gepflegt werden, spiegeln aber den Genotyp der Primärtumoren immer noch nicht vollständig wider2,3. Direkte orthotopische Transplantation negiert die Einflüsse der In-vitro-Kultur, bietet eine angemessene Mikroumgebung und bewahrt die Integrität von tumorinitiierenden Zellen9,10. Daher stellen primäre Xenografts ein leistungsfähiges und relevantes präklinisches Modell für die gründliche Prüfung gezielter Wirkstoffe dar, um bei der rationalen Gestaltung zukünftiger klinischer Studien zu helfen5,11,12.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Papain dissociation system</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td>Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Ophthalmic ointment&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Povidone-iodine&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;190061617&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cryopreservation medium and proliferation supplement&lt;/p&gt; </td><td>StemCell Technologies</td><td>&lt;p&gt;05751&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;0.2% Heparin sodium salt in PBS&lt;/p&gt; </td><td>StemCell Technologies</td><td>&lt;p&gt;07980&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Penicillin-streptomycin&lt;/p&gt; </td><td>Life Technologies</td><td>&lt;p&gt;15140-122&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Dimethyl sulfoxide&lt;/p&gt; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;p&gt;D6250-5X10ML&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;NOD.Cg-&lt;em&gt;Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt; I/2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/SzJ mice&lt;/p&gt; </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>&lt;p&gt;005557&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;NSG mice&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-human vimentin antibody&lt;/p&gt; </td><td>Dako</td><td>&lt;p&gt;M7020&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Use 1:200 to 1:800&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Anti-human IDH1 R132H antibody&lt;/p&gt; </td><td>Dianova</td><td>&lt;p&gt;DIA-H09&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Use 1:100 to 1:400&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Centrifuge with swinging bucket rotor&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Pipetter with dispensing speed control&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Disposable hemocytometer&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;22-600-100&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Sterile surgical gloves&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;11-388128&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Disposable gown&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;18-567&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Surgical mask&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;19-120-1256&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Tuberculin syringe&lt;/p&gt; </td><td>BD</td><td>&lt;p&gt;305620&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Alcohol pads&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;22-246-073&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Portable electronic scale&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;01-919-33&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Zoom stereomicroscope&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Surgical clipper&lt;/p&gt; </td><td>Stoelting</td><td>&lt;p&gt;51465&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Scalpel handle&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;10003-12&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Scalpel blades, #10&lt;/p&gt; </td><td></td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Stereotaxic instrument&lt;/p&gt; </td><td>Stoelting</td><td>&lt;p&gt;51730&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;High-speed drill&lt;/p&gt; </td><td>Stoelting</td><td>&lt;p&gt;51449&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>Drill bit, 0.6 mm</td><td>Stoelting</td><td>514552</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Hamilton syringe&lt;/p&gt; </td><td>Hamilton</td><td>&lt;p&gt;80336&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Autoclip, 9 mm&lt;/p&gt; </td><td>BD</td><td>&lt;p&gt;427630&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Circulating water warming pad&lt;/p&gt; </td><td>Kent Scientific</td><td>&lt;p&gt;TP-700&lt;/p&gt; &lt;p&gt;TP-1215EA&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Hot bead dry sterilizer&lt;/p&gt; </td><td>Kent Scientific</td><td>&lt;p&gt;INS300850&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Surgical scissors&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;14101-14&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Fine scissors&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;14094-11&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Spring scissors&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;15018-10&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Dumont forceps&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;11251-30&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Semimicro spatulas&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;14374&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Mouse brain slicer matrix&lt;/p&gt; </td><td>Zivic Instruments</td><td>&lt;p&gt;BSMAS002-1&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cryogenic storage vials&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;12-567-501&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase i mutation

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen. Um die WHO-Grade III und IV maligne Gliome in Transplantationstests zu modellieren, werden menschliche Tumorzellen in eine orthotopische Stelle, das Gehirn, von immungeschwächten Mäusen xenografiert. Im Gegensatz zu sekundären Xenografts, die kultivierte Tumorzellen nutzen, werden menschliche Gliomzellen von resezierten Proben getrennt und ohne vorherige Passage in der Gewebekultur transplantiert, um primäre Xenografts zu erzeugen. Das Verfahren in diesem Bericht beschreibt die Tumorprobenvorbereitung, die intrakranielle Transplantation in immungeschwächte Mäuse, die Überwachung der Tumorenpfroptmentierung und die Tumorernte für den späteren Übergang in Empfängertiere oder die Analyse. Tumorzellpräparat erfordert 2 Stunden und chirurgische Eingriffe erfordern 20 min/Tier.

Dissoziierte Gliomzellen werden direkt in das Gehirn immungeschwächter Mäuse transplantiert, um primäre orthotopische Xenograft-Linien zu erhalten. Jeder Tumorprobe wird vor der Transplantation eine randomisierte Zahl zugewiesen, als Teil des Deidentifizierungsprozesses, um geschützte Gesundheitsinformationen zu entfernen. Dazu verwenden wir eine 5-stellige REDcap-Datenbanknummer. Abbildung 1 zeigt den Prozess und die Nomenklatur zur Herstellung einer Xenograft-Linie aus einem Glioblastom (GBM 17182)...

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Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

8.0K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center. Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Serie: Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

Forschung

Neurowissenschaften

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Krebsforschung

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Medizin

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Ableitung von 3D-Gliom-Organoiden aus Chopper-prozessierten Patiententumoren

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing realistic ex vivo models remain challenging. Patient-derived 3-dimensional organoid (PDO) models offer innovative platforms that capture the phenotypic and molecular heterogeneity of GBM, while preserving key characteristics of the original tumors. However, manual dissection for PDO generation is time-consuming, expensive and can result in a number of irregular and unevenly sized PDOs. This study presents an innovative method for PDO production using an automated tissue chopper. Tumor samples from four GBM and one astrocytoma, IDH-mutant, CNS WHO grade 2 patients were processed manually as well as using the tissue chopper. In the manual approach, the tumor material was dissected using scalpels under microscopic control, while the tissue chopper was employed at three different angles. Following culture on an orbital shaker at 37 &#176;C, morphological changes were evaluated using bright field microscopy, while proliferation (Ki67) and apoptosis (CC3) were assessed by immunofluorescence after 6 weeks. The tissue chopper method reduced almost 70% of the manufacturing time and resulted in a significantly higher PDOs mean count compared to the manually processed tissue from the second week onwards (week 2: 801 vs. 601, P = 0.018; week 3: 1105 vs. 771, P = 0.032; and week 4:1195 vs. 784, P &lt; 0.01). Quality assessment revealed similar rates of tumor-cell apoptosis and proliferation for both manufacturing methods. Therefore, the automated tissue chopper method offers a more efficient approach in terms of time and PDO yield. This method holds promise for drug- or immunotherapy-screening of GBM patients.

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Generierung von patienteneigenen 3D-Organoiden für Glioblastome und Gliome

This study introduces an automated method to generate patient-derived glioblastoma 3-dimensional organoids utilizing a tissue chopper. The method provides a suitable and effective approach to obtain such organoids for therapeutical testing.

Kultivierung von ex vivo patienteneigenen Gliom-Organoiden mit einem Gewebe-Chopper

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und

Imaging Gliom Initiation

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Kultivierung von ex vivo patienteneigenen Gliom-Organoiden mit einem Gewebe-Chopper

Kultivierung von ex vivo patienteneigenen Gliom-Organoiden mit einem Gewebe-Chopper

Kultivierung von ex vivo patienteneigenen Gliom-Organoiden mit einem Gewebe-Chopper