Describimos la técnica óptima para la inyección intracraneal de células de glioblastoma derivadas de GEM en un cerebro de ratón inmunocompetente que resulta en tumores que recapitulan las características clave del glioblastoma humano. Esta técnica para la inyección ortotópica de células TRP derivadas de GEM produce resultados altamente reproducibles, escalables y consistentes para tumores que se originan en la corteza, pero mantienen la invasividad de los tumores GEM. Los tumores cerebrales de glioblastoma de ratón muestran un crecimiento agresivo e invaden el parénquima cerebral circundante.
Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar terapias que pueden suprimir la infiltración y migración tumoral en pacientes. Este protocolo puede personalizarse para otros modelos de tumores cerebrales, virus, terapias o adaptarse para su inyección en diferentes regiones cerebrales con los ajustes de coordenadas estereotáxicas. Demostrando el procedimiento estará Devon Atkinson, un investigador asociado de mi laboratorio.
Para comenzar, coloque protectores de superficie debajo del aparato estereotáxico y en la superficie de trabajo. Conecte el tubo de vinilo de la máquina de anestesia al puerto de entrada de la plataforma de anestesia de gas del aparato estereotáxico, y otro tubo a su puerto de salida. Conecte la pantalla digital a una fuente de alimentación y al aparato.
A continuación, conecte la microbomba al brazo manipulador del aparato después de conectar el controlador de la microbomba a la fuente de alimentación. Ajuste la microbomba a 5,6 nanolitros por segundo. Conecte la almohadilla térmica del ratón al controlador de temperatura y a una fuente de alimentación.
Vuelva a cargar una jeringa de precisión de calibre 30 con una mezcla de células de metilmetilcelulosa evitando burbujas. Después de insertar el émbolo, coloque la aguja y presione el émbolo hasta que la mezcla celular cargada caiga a través de la aguja. Limpie la aguja con una almohadilla de preparación de alcohol al 70%.
Una vez que la jeringa de precisión esté conectada a la microbomba, gire el brazo manipulador lejos del escenario antes de colocar el ratón para evitar el desplazamiento de la aguja de la jeringa. Transfiera el ratón anestesiado al instrumento estereotáxico y asegúrelo al cono de la nariz colocando los dientes superiores en el soporte del cono de la nariz. Después de apretar el cono de la nariz con una perilla, pellizque un dedo del pie para verificar los reflejos y garantizar una anestesia adecuada.
Luego inserte barras para los oídos y apriete la perilla para asegurar la cabeza. Aplique ungüento para los ojos para lubricar los ojos en condiciones anestesiadas. Inyecte buprenorfina SR analgésico por vía subcutánea y coloque una sonda rectal de ratón para controlar la temperatura interna.
Esterilice el campo quirúrgico usando círculos hacia afuera, alternando entre un exfoliante quirúrgico y etanol tres veces. Tire de la piel tensa con fórceps y use una hoja de bisturí para hacer una incisión de aproximadamente 1 centímetro de largo entre los ojos. Para la inyección celular, devuelva el brazo manipulador con la jeringa conectada al ratón.
Después de apretar las perillas, mueva la jeringa usando las perillas X e Y en el plano horizontal y móntela sobre el bregma. Baje la aguja, usando la perilla Z, para confirmar la posición bregma y ajuste la consola de lectura digital a cero. Luego mueva la aguja a la posición deseada, como se describe en el manuscrito, usando las perillas X e Y y la lectura digital correspondiente, y use la perilla Z para mover la aguja a la superficie del cráneo.
Perfore un agujero en el cráneo con una jeringa de 1 mililitro con una aguja de calibre 25 conectada. Gire con cuidado el brazo manipulador hacia un lado, mientras coloca el bisel de la aguja hacia la jeringa de precisión de calibre 30. Una vez que el brazo manipulador con la aguja de jeringa de precisión cargada se coloque sobre el orificio, alinee la punta de la aguja con el orificio y use la perilla Z para bajar la aguja en la duramadre del cerebro.
Después de ajustar la consola de lectura digital a cero, baje la aguja 1 milímetro con la perilla Z y espere un minuto. Una vez que se alcance la profundidad de 2 milímetros, detenga la microbomba y asegúrese de que la bomba se detenga cuando se hayan inyectado 2 microlitros de suspensión celular. Para quitar la aguja del cráneo, levántela un milímetro y espere un minuto.
Para el cierre de la herida, usando el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón, tome un trozo de cera ósea y forme una forma de cono. Después de colocar la cera en la abertura del cráneo, empújela hacia el agujero. Use las pinzas esterilizadas con cuentas para derretir la cera restante en el cráneo.
Una vez que se vuelva suave, agregue dos gotas de solución anestésica de bupivacaína en la incisión y junte los bordes de la piel, usando fórceps. Después de tensar la piel, usando uno o dos clips para heridas, cierre la piel, coloque el mouse en una jaula de recuperación limpia en una almohadilla térmica en un área libre de corrientes de aire y observe de cerca al mouse. Las resonancias magnéticas semanales mostraron un aumento de la carga tumoral dentro del cerebro y mediciones del volumen tumoral.
La medición del volumen tumoral de la resonancia magnética reveló una falta de supresión del crecimiento tumoral incluso después del tratamiento con radiación, y la supervivencia de los ratones tratados no aumentó. Los tumores GBM en modelos singénicos parecían crecer agresivamente y rompieron el cráneo por el punto final terminal. Si se observa crecimiento extracraneal en las imágenes después de la implantación celular, esto indica fuga de células durante el proceso de inyección, y se debe tener más cuidado durante la retirada de la aguja de inyección.
La histopatología de los tumores ortotópicos TRP GBM confirmó la presencia de astrocitoma de grado 4, incluida la recapitulación de las características distintivas en tumores como la pseudopalisading y la necrosis. Sea preciso al establecer el punto cero en bregma para garantizar las coordenadas correctas de inyección celular. Bajar y levantar la aguja en el cerebro debe ser lento para evitar traumas y reflujo.
Después de la inyección de células tumorales, se pueden usar imágenes por resonancia magnética semanales para determinar el tamaño inicial del tumor antes de comenzar el tratamiento y para visualizar la carga tumoral cambiante dentro del cerebro.
