Мы описываем оптимальную технику внутричерепной инъекции клеток глиобластомы, полученных из GEM, в иммунокомпетентный мозг мыши, что приводит к опухолям, которые повторяют ключевые особенности глиобластомы человека. Этот метод ортотопической инъекции TRP-клеток, полученных из GEM, дает высоковоспроизводимые, масштабируемые и последовательные результаты для опухолей, которые возникают в коре, но сохраняют инвазивность опухолей GEM. Опухоли головного мозга глиобластомы мыши демонстрируют агрессивный рост и вторгаются в окружающую паренхиму мозга.
Таким образом, его можно использовать для оценки терапевтических средств, которые могут подавлять инфильтрацию и миграцию опухоли у пациентов. Этот протокол может быть адаптирован для других моделей опухолей головного мозга, вирусов, терапевтических средств или адаптирован для инъекций в различные области мозга с корректировкой стереотаксических координат. Продемонстрирует процедуру Девон Аткинсон, научный сотрудник моей лаборатории.
Для начала поместите поверхностные протекторы под стереотаксический аппарат и на рабочую поверхность. Подсоедините виниловую трубку от наркозного аппарата к внутреннему порту газоанестезиологической платформы стереотаксического аппарата, а другую трубку к ее выходному отверстию. Подключите цифровой дисплей к источнику питания и устройству.
Затем прикрепите микронасос к манипулятору аппарата после подключения контроллера микронасоса к источнику питания. Установите микронасос на 5.6 нанолитров в секунду. Подключите грелку мыши к регулятору температуры и источнику питания.
Загрузите прецизионный шприц 30-го калибра смесью ячеек метилметилцеллюлозы, избегая пузырьков. Вставив поршень, присоедините иглу и нажимайте на поршень, пока загруженная клеточная смесь не упадет через иглу. Очистите иглу прокладкой для приготовления 70%-ного спирта.
После того, как прецизионный шприц прикреплен к микронасосу, поверните рычаг манипулятора в сторону от сцены, прежде чем поместить мышь, чтобы предотвратить смещение иглы шприца. Перенесите анестезированную мышь на стереотаксический инструмент и закрепите ее на носовом конусе, поместив верхние зубы на опору носового конуса. Затянув носовой конус ручкой, зажмите палец ноги, чтобы проверить рефлексы, чтобы обеспечить надлежащую анестезию.
Затем вставьте ушные планки и затяните ручку, чтобы зафиксировать головку. Нанесите глазную мазь для смазывания глаз в анестезированных условиях. Введите бупренорфин SR анальгетик подкожно и поместите ректальный зонд мыши для контроля внутренней температуры.
Стерилизуйте операционное поле, используя наружные круги, чередуя хирургический скраб и этанол три раза. Потяните натянутую кожу щипцами и используйте лезвие скальпеля, чтобы сделать разрез между глазами длиной примерно 1 сантиметр. Для инъекции клеток верните руку-манипулятор со шприцем, прикрепленным к мыши.
Затянув ручки, переместите шприц с помощью ручек X и Y в горизонтальной плоскости и установите его на брегму. Опустите стрелку с помощью Z-ручки, чтобы подтвердить положение брегмы, и установите консоль цифрового считывания на ноль. Затем переместите иглу в нужное положение, как описано в рукописи, используя ручки X и Y и соответствующее цифровое считывание, и используйте ручку Z, чтобы переместить иглу на поверхность черепа.
Проколите отверстие в черепе с помощью шприца объемом 1 миллилитр с прикрепленной иглой 25-го калибра. Осторожно поверните руку манипулятора в сторону, одновременно направляя скос иглы к прецизионному шприцу 30-го калибра. После того, как манипулятор с загруженной прецизионной иглой шприца расположен над отверстием, совместите кончик иглы с отверстием и используйте Z-образную ручку, чтобы опустить иглу в твердую мозговую оболочку.
Установив консоль цифрового считывания на ноль, опустите стрелку на 1 миллиметр с помощью Z-ручки и подождите одну минуту. Как только глубина 2 миллиметра будет достигнута, остановите микронасос и убедитесь, что насос останавливается при введении 2 микролитров клеточной суспензии. Чтобы извлечь иглу из черепа, поднимите ее на один миллиметр и подождите одну минуту.
Для закрытия раны с помощью деревянного конца аппликатора с ватным наконечником возьмите кусочек костного воска и сформируйте из него конус. Поместив воск в отверстие в черепе, протолкните его в отверстие. Используйте стерилизованные щипцы, чтобы растопить оставшийся воск на черепе.
Как только он станет гладким, добавьте две капли обезболивающего раствора бупивакаина в разрез и стяните края кожи вместе с помощью щипцов. Натянув кожу, используя один или два зажима для намотки, закройте кожу, поместите мышь в чистую клетку для восстановления на грелке в месте, свободном от сквозняков, и внимательно наблюдайте за мышью. Еженедельные МРТ-сканирования показали увеличение опухолевой нагрузки в головном мозге и измерения объема опухоли.
Измерение объема опухоли с помощью МРТ выявило отсутствие подавления роста опухоли даже после лучевой терапии, и выживаемость обработанных мышей не была увеличена. Опухоли GBM в сингенных моделях, по-видимому, росли агрессивно и нарушали череп к конечной конечной точке. Если экстракраниальный рост наблюдается на визуализации после имплантации клеток, это указывает на утечку клеток во время процесса инъекции, и следует соблюдать большую осторожность во время извлечения инъекционной иглы.
Гистопатология ортотопических опухолей TRP GBM подтвердила наличие астроцитомы 4 степени, включая повторение отличительных признаков опухолей, таких как псевдопалисадирование и некроз. Будьте точны при установке нулевой точки в bregma, чтобы обеспечить правильные координаты инъекции клеток. Опускание и подъем иглы в головном мозге должно быть медленным, чтобы предотвратить травму и обратный поток.
После инъекции опухолевых клеток еженедельное МРТ-сканирование может быть использовано для определения исходного размера опухоли до начала лечения и для визуализации изменения опухолевой нагрузки в головном мозге.
