Diese neue Methode zur Analyse der Reverse-Transkription kann uns neue Dinge über den Bereich der Retro-Virologie erzählen. Zum Beispiel können wir mehr darüber erfahren, wie zelluläre Restriktionsfaktoren funktionieren oder wie antiretrovirale Medikamente die HIV1-DNA-Synthese hemmen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie nicht nur Informationen über die Sequenz von Nascent Reverse Tran Scrips liefert, sondern auch die Kartierung ihrer präzisen 3-Prime-DNA-Termini bei einer einzigen nuklearen engen Auflösung ermöglicht.
Die Anreicherung von HIV1-Komplementären DNAs aus der Großhandels-DNA von HIV1-infizierten Zellen erfolgt durch Hybrid-Capture und sollte an einem PCR-Arbeitsplatz durchgeführt werden. Bereiten Sie eine Master-Mischung aus magnetischen Streptavidin-Perlen vor, indem Sie hundert Mikroliter Perlen pro Probe in ein einziges Mikrozentrifugenrohr leiten, indem Sie das Rohr auf einen Magneten legen, der für Mikrozentrifugenröhren geeignet ist. Nachdem sich die Perlen in Richtung der Magnetseite des Rohres gelegt haben, entfernen Sie den Speicherpuffer, entfernen Sie das Rohr vom Magneten und hängen Sie die Perlen in fünfhundert Mikrolitern bindent Wash oder BW-Puffer wieder auf.
Legen Sie das Rohr wieder auf den Magneten, warten Sie, bis die Perlen zum Magneten wandern, und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten, fügen Sie fünfhundert Mikroliter Caseinlösung hinzu, hängen Sie die Perlen wieder auf und brüten sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach zehn Minuten die Perlen mit BW-Puffer waschen.
Legen Sie das Rohr wieder auf den Magneten, entfernen Sie den Überstand und hängen Sie die Perlen in fünfhundert Mikroliter BW-Puffer wieder auf. Fügen Sie fünfzig Picomole von jedem gefangenen biotinylierten Oligonukleotid pro Probe hinzu. Bei Raumtemperatur inkubieren, während sie dreißig Minuten lang in einem End-over-End-Mixer schaukeln.
Als nächstes geben Sie das Rohr zum Magneten zurück, entfernen Sie den Überstand, entfernen Sie das Rohr vom Magneten, fügen Sie fünfhundert Mikroliter 1x zehn Puffer hinzu und hängen Sie die Perlen wieder auf. Nach der zweiten Wäsche die Perlen mit den immobilisierten Oligonukleotiden in zehn Mikrolitern 1x zehn Puffer pro Probe wieder aufhängen. Etikettieren Sie für jede Probe ein Mikrocetrofuge-Rohr und fügen Sie zehn Mikroliter Perlensuspension, einhundertsiebzig Mikroliter DNA und neunzig Mikroliter 3x-zehn Puffer hinzu.
In einem trockenen Hitzeblock bei zweiundneunzig Grad Celsius für zwei Minuten inkubieren, um die DNA zu entwidmen. Bewegen Sie die Rohre in einen anderen trockenen Wärmeblock, der auf zweiundfünfzig Grad Celsius eingestellt ist, und brüten Sie für eine Stunde. Alle zehn Minuten während dieser Inkubation, invertieren die Rohre zu mischen.
Wenn die einstündige Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Perlen einmal mit fünfhundert Mikroliter1x zehn Puffer, und setzen Sie in fünfunddreißig Mikroliter nuklease freies Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich die Perlen gut absetzen, indem Sie die Rohre für etwa drei Minuten auf dem Magneten lassen, bevor Sie Flüssigkeit entfernen. Um zu elute, inkubieren Sie die Rohre bei zweiundneunzig Grad Celsius in einem trockenen Wärmeblock für zwei Minuten.
Dann bewegen Sie die Rohre schnell auf den Magneten, ein Rohr nach dem anderen. Sobald die Perlen an die Seite der Röhre gebunden sind, übertragen Sie den Überstand, der die HIV1-DNA enthält, in ein frisches Rohr. Um dieses Verfahren zu beginnen, setzen Sie den lyophilisierten Adapter bei hundert Mikromolaren in nuklease freiem Wasser und Wirbel das Rohr.
Pro Probe, plus eine Kontrollprobe, kombinieren NullPunkt vier fünf Mikroliter von 10x T4 DNA Ligase Puffer, vier Mikroliter Adapter, und Punkt Null fünf Mikroliter Nuklease freies Wasser. Zwei Minuten auf zweiundneunzig Grad Celsius erhitzen und dann in einer PCR-Maschine langsam auf sechzehn Grad Celsius abkühlen lassen. Dadurch kann der Adapter eine Haarnadelstruktur bilden.
Der schlüsselfertige Schritt in diesem Verfahren ist die effiziente und unvoreingenommene Ligation von angepassten Molekülen, um 3-Prime-DNA-Termini zu öffnen. Gereinigte entstehende cDNA-Moleküle unterschiedlicher Länge werden mit T4-DNA-Ligase zu einem einsträngigen DNA-Adapter der Haarnadel ligiert. Der Adapter trägt eine zufällige sechs Nukleotid-Barcode-Sequenz, die Paring ermöglicht, um Ligation zu erleichtern, und dient gleichzeitig als Identifikator für eindeutige Lesevorgänge.
Der 3-Prime-Termini-Adapter trägt einen Abstandshalter, um selbst ligtion zu verhindern. Um sechzig Mikroliter Endvolumen-Ligationsreaktionen einzurichten, fügen Sie zu jeder PCR-Röhre folgendes hinzu: sechs Mikroliter 10x T4 DNA-Ligasepuffer, vierundzwanzig Mikroliter von vierzig Prozent PEG, sechs Mikroliter von fünf molaren Betain, vier Punkt fünf Mikroliter Adapter, einen Punkt zwei Mikroliter T4 DNA-Ligase und zeigen achtzehn Mikroliter DNA. Nachdem Sie die Reaktionen gut gemischt haben, in einer PCR-Maschine bei sechzehn Grad Celsius über Nacht inkubieren.
Am Tag nach der Adaptorligation bei dreißig MikroliterN Formamid, die DNA-Gel-Ladepuffer für jede Ligationsreaktion enthalten, und gut nach Rohrüberschrift mischen. In einer PCR-Maschine zwei Minuten lang bei vierundneunzig Grad Celsius erhitzen und dann sofort auf Eis legen. Der nächste Schritt ist die Vorbereitung auf die Denaturierung der Gelelektrophorese.
Legen Sie ein vorgegossenes sechs Prozent TBE-denaturierendes Harnstoffpolyacrylamid-Gel in einen geeigneten Geltank und fügen Sie 1x TBE-Laufpuffer hinzu. Führen Sie das Gel für zwanzig Minuten vor. Als nächstes verwenden Sie eine Spritze und eine 21 Gauge Nadel, um die Geltaschen mit Laufpuffer auszuwaschen.
Dann laden Sie dreißig Mikroliter pro Brunnen der gleichen Probe in drei Brunnen. Es ist ratsam, nur eine Probe pro Gel auszuführen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Laufen Sie für zwanzig Minuten.
Während das Gel läuft, bereiten Sie drei Nullpunkt fünf Milliliter Mikrozentrifugen-Rohre pro Probe, indem Sie eine einundzwanzig Meter Spritzennadel verwenden, um Löcher in den Boden zu stochern. Legen Sie jedes der vorbereiteten Rohre in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr ein und beschriften Sie sie mit dem Probennamen plus niedrig, mitte oder hoch. Wenn die dunkelblaue Farbfront etwa auf halbem Weg durch das Gel ist, stoppen Sie die Elektrophorese und entfernen Sie die Gelkassette.
Öffnen Sie die Kassette und schneiden Sie das Gel vertikal mit einer Rasierklinge. Um den Streifen großzügig mit drei Brunnen geladener Proben zu verbrauchen. Den Gelstreifen in einen Behälter mit 1x TBE und fünf MikroliterN Cyanin-Nukleinsäure-Färbung geben und drei bis fünf Minuten inkubieren.
Stellen Sie sicher, dass die Färbung ausreichend ist, um die Oberseite des freien Adapters, der später entfernt werden soll, leicht zu identifizieren. Als nächstes reinigen Sie die Oberfläche eines blaulichttransilluminator gründlich mit destilliertem deionisiertem Wasser. Dann nehmen Sie das Gelstück aus dem Färbebehälter und legen Sie es auf den Leuchtkasten.
Schalten Sie den Leuchtkasten ein und inspizieren Sie die gefärbten Nukleinsäuren durch den Orangenfilter. Eine repräsentative ligaierte DNA-Probe auf einem gefärbten Gel ist hier zu sehen. Der Adapter erscheint in der Regel überlastet und läuft als großer Blob mit ligated HIV1 DNA, die oben als Streifen läuft.
Die roten Linien zeigen die Stellen an, an der das Gel geschnitten werden soll, um den freien Adapter zu entfernen und die Probe in drei gerade Stücke zu teilen. Schneiden Sie mit einer neuen Rasierklinge die Seiten des Gels weg, wenn noch Bereiche ohne geladene Probe vorhanden sind. Als nächstes schneiden Sie knapp über dem Adapter, um den Adapter und niedrigere Gelteile zu entfernen.
Schließlich schneiden Sie die Spitze des Gels einschließlich etwa einem Millimeter der Geltaschen, die oft ein scharfes intensives Signal von höhermolekularer DNA haben. Teilen Sie das verbleibende Gelstück, das die Probe enthält, horizontal in drei gerade Stücke. Niedrige, mittlere und hochmolekulare Bereiche.
Dann schneiden Sie jedes der drei Gelfragmente in zwei mal zwei Millimeter Stücke und übertragen Sie sie in die vorbereiteten Nullpunkt fünf Milliliter Mikrozentrifugenrohre. Drehen Sie mit Höchstgeschwindigkeit mit offenen Deckeln für eine Minute. Um die Gelstücke durch das Loch in die Zwei-Milliliter-Röhre zu drücken, um einen Gel schlammzuschaffen.
Wenn Gelpartikel im Boden des Nullpunkt-Fünf-Milliliter-Rohrs verbleiben, übertragen Sie sie manuell mit einer Nadel in das Zwei-Milliliter-Rohr. Beginnen Sie das DNA-Extraktionsverfahren, indem Sie dem Gel-Slush in jedem Mikrozentrifugenrohr einen Milliliter Harnstoff-Gel-Extraktionspuffer hinzufügen. Drehen Sie die Rohre mit einem Ende über Endmischer bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden.
Bereiten Sie die Filterspalten vor. Verwenden Sie eine saubere Pinzette, um jeder Zentrifugensäule einen kleinen Rundenglasfaserfilter mit Celluloseacetat-Membranfiltern hinzuzufügen, der eine Verstopfung der Membran verhindert. Setzen Sie den Filter mit einer invertierten Rohrkopfspitze ein.
Drehen Sie die beiden Milliliter-Röhren mit Gelschlamm und Extraktionspuffer in einer Mikrozentrifuge kurz und übertragen Sie siebenhundert Mikroliter des Überstandes auf die vorbereiteten Filtersäulen. Zentrifugieren Sie die Filtersäulen in einer Mikrozentrifuge mit Höchstgeschwindigkeit für eine Minute. Dann übertragen Sie den Durchfluss auf ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.
Laden Sie die Spalten mit dem verbleibenden Überstand neu. Versuchen Sie, so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Extraktionsschlamm zu erhalten und machen Sie sich keine Sorgen, wenn Gelstücke enthalten sind. Drehen Sie wieder.
Kombinieren Sie den Durchfluss der gleichen Extraktionsproben, und fahren Sie wie im Textprotokoll beschrieben fort. Dieses Protokoll wurde in Proben von CEMS-ST-Zellen verwendet, die in Abwesenheit oder Vorhandensein des antiretroviralen menschlichen Proteins A3G mit Vif-defizient HIV-1 infiziert waren. Ein Diagramm der Gesamtzahl der eindeutigen Lesevorgänge, die aus jeder Stichprobe erhalten wurden, zeigt an, dass steigende A3G-Werte die Gesamtlesezahl verringern.
Reflexion der hemmenden Wirkung von A3G auf die reverse Transkriptase vermittelte Cdna-Synthese. In diesen nächsten drei Diagrammen wird der Anteil der Moleküle auf jeder möglichen Länge innerhalb der ersten einhundertzweiundachtzig Nukleotide in blauen Histogrammen dargestellt. Die Zugabe von A3G kostete einen starken Anstieg der kürzeren abgeschnittenen Cdna-Moleküle an einigen sehr spezifischen reproduzierbaren Positionen.
Die gestrichelten roten Linien zeigen die Prozentsätze der Lesevorgänge, die C- bis T-Mutationen an der jeweiligen Position tragen. Eine positive Kontrolle kann durch die Verarbeitung eines Pools von synthetischen Oligonukleotiden von Know-Sequenz, Länge und Konzentration erzeugt werden. Alle Moleküle sollten in nahezu gleicher Fülle mit nur kleinen Variationen erscheinen.
Wenn ein Bibliothekslauf eine geringfügige Längenverzerrung erzeugt, ist es ratsam, bei der Sequenzierung einen Normalisierungsfaktor anzuwenden, der von der Neigung abgeleitet wird, die die Größenverzerrung darstellt. Dieses Verfahren kann leicht an andere Systeme angepasst werden, bei denen die Bestimmung der drei Hauptenden der DNA-Moleküle wichtige Erkenntnisse in den Nukleinsäurestoffwechsel geben würde. Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV extrem gefährlich sein kann und einige Infektionen sollten nur in bestimmten Sicherheitslabors durchgeführt werden.
