Die 3D-Kultur erschwert die Messung der zellulären Funktion mithilfe von biologischen Standardtests. Dieses Protokoll ermöglicht die Messung der zellulären und somatischen Aktivität ohne weitere Probenverarbeitung mit einem Fluoreszenzsensor und einem Standard-Mikroplattenleser. Dieses Protokoll ermöglicht eine Reihe neuer Anwendungen, einschließlich des Arzneimittelscreenings mit hohem Durchsatz.
Zusätzlich kann der Fluoreszenzsensor mit einem anderen Sensor ausgetauscht werden, um andere Proteasen oder Zellfunktionen zu messen. Es ist wichtig, das Experiment im Voraus sorgfältig zu planen, alle Berechnungen für die Hydrogelzubereitung abzuschließen und alle Geräte und Reagenzien einzurichten, um die Zeit zu minimieren, in der sich zellenin der Suspension befinden. Zu Beginn bereiten Sie die Assay-Medien mit 1%Holzkohle abgestreift fetal esboserum, zwei mM L-Glutamin, 10 Einheiten pro ml Penicillin und 10 Mikrogramm pro ml Streptomycin.
Verwenden Sie keine phenolroten Medien, die mehr Fluoreszenzstörungen aufweisen. Um positive Kontrollen zu machen, fügen Sie dem Assay-Medium in den Konzentrationen von 10 und 1000 Mikrogramm pro ml bakterielles Kollagennase-Enzym Typ 1 hinzu. Als nächstes bereiten Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung vor, indem Sie die Reagenzien zu einem 1,5 ml-Rohr hinzufügen.
Achten Sie darauf, nach dem Hinzufügen der einzelnen Komponenten zu wirbeln. Dann teilen Sie die Lösung in mehrere 1,5 ml Rohre für verschiedene Bedingungen. Um Zellen in Hydrogele zu kapseln, bereiten Sie zunächst eine einzellige Suspension vor, indem Sie eine 10 cm lange Schale a375 Melanomzellen mit 10 ml PBS waschen.
Fügen Sie dann 0,05% Trypsin zur Schale hinzu, um Zellen zu trypsinisieren. Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, für drei Minuten. Zählen Sie die Zellen nach der Inkubation mit einem Hämozytometer.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Zelllösung bei 314 mal G für drei Minuten. Saugen Sie die Kulturmedien an, und setzen Sie Zellen im PBS-Puffer etwa dreimal so hoch wie die endgültige gekapselte Dichte aus. Zählen Sie die Zellen erneut, um eine genaue Zellkonzentration zu gewährleisten.
Fügen Sie dann suspendierte Zellen in PBS zu jedem Rohr der Hydrogel-Vorläuferlösung entsprechend der erforderlichen Saatdichte hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten. Fügen Sie bei kontrollierten Bedingungen nur PBS und Wirbel hinzu. Als nächstes Pipette 10 Mikroliter der Hydrogel-Vorläuferlösung in die Mitte jedes Brunnens einer sterilen, schwarzen, runden 96-Wellplatte.
Die Platzierung der Hydrogele in den Brunnen visuell inspizieren. Nicht zentrierte Hydrogele können vor der Polymerisation mit einer Pipettenspitze neu positioniert werden. Um die Hydrogel-Vorläuferlösung zu polymerisieren, setzen Sie die Platte drei Minuten lang mit 4 Milliwatt pro Quadratzentimeter UV-Licht aus.
Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter der Assay-Medien zu allen Brunnen hinzu, die verkapselte Zellen enthalten, und 150 Mikroliter der Kollagenase-Enzymlösung zu den Brunnen positiver Kontrollen. Fügen Sie 150 Mikroliter PBS-Puffer in die äußeren Brunnen der Platte, um die Verdunstung während der Inkubation zu reduzieren. Verwenden Sie einen Mikroplattenleser, um die fluoreszierende Intensität der Platte bei Nullstunde zu messen, sofort nach der Verkapselung.
Wählen Sie das undurchsichtige 96-Well-Plattenprotokoll mit 494 Nanometer Anregung und 521 Nanometer Emissionswellenlängen. Als nächstes, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid, für 18 Stunden. Dann fügen Sie metabolische Aktivität Reagenzien bei einem ein bis zehn Volumen-Volumen-Verhältnis pro Brunnen für alle Bedingungen und Kontrollen.
Inkubieren Sie die Platte in 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, für sechs Stunden. Schließlich messen Sie die fluoreszierende Intensität der Platte bei 24 Stunden, nach der Verkapselung. Wählen Sie das undurchsichtige 96-Well-Plattenprotokoll mit 494 Nanometer Anregung und 521 Nanometer-Emissionswellenlängen für MMP-Aktivität.
Um die metabolische Aktivität zu messen, wählen Sie 560 Nanometer Anregung und 590 Nanometer Emissionswellenlängen. In dieser Studie werden bei Exposition des fluorogenen Sensors bei der entsprechenden Protease die Quener und das Fluorophor getrennt und die Fluoreszenz nimmt zu. Fluoreszenzmessungen der inkubierten Hydrogele mit bakteriellem Kollagennase-Enzym Typ 1 zeigen, dass das niedrigste erkannte Signal durch Negativkontrollen ohne Kollagenase erzeugt wurde.
Während das höchste erkannte Signal um 1000 Mikrogramm pro ml Kollagenase oder höher erzeugt wurde, wenn das Signal beginnt, Plateau. Der berechnete Arbeitsbereich lag zwischen etwa 0,16 und 474 Mikrogramm pro ml Kollagennase. Fluoreszenzwerte für die A375-Melanom-Zelllinie, die direkt nach der Verkapselung in einer Reihe von Dichten eingekapselt waren, waren über die Sädichte hinweg niedrig und ähnlich wie bei Kontrollgelen ohne Zellen wie erwartet.
24 Stunden nach der Verkapselung war die MMP-Aktivität direkt proportional zur Saatdichte, und die Sädichte von mindestens 1 Million Zellen pro ml fiel innerhalb der Grenzen des Arbeitsbereichs. Metabolische Aktivitätsmessungen der A375-Zelllinie waren ebenfalls direkt proportional zur Zellsaatdichte. Durch die Normalisierung der MMP-Aktivität auf die metabolische Aktivität gab es keinen signifikanten Unterschied in der MMP-Aktivität pro Zelle bei säender Dichten von mehr als 2 Millionen Zellen pro ml.
Richtige Pipettiertechniken sind wichtig. Dazu gehören Vorbenetzungstipps, um genaue Volumina von viskosen Lösungen zu erreichen. Auch die Zentrierung der Hydrogel-Vorläuferlösung im Brunnen ist entscheidend, um genaue Messungen durch den Plattenleser zu erreichen.
Um bestimmte MMPs zu identifizieren, die zur hier gemessenen MMP-Aktivität beitragen, könnten Ausdruckstests wie Western Blot oder PCR verwendet werden. Die Verwendung lebender Zellen erfordert ein angemessenes Biosicherheitsverfahren, aseptische Technik und einen biologischen Sicherheitsschrank. Das UV-Licht ist gefährlich, verwenden Sie einen Schild, um den Benutzer zu schützen, und schauen Sie nicht direkt in das Licht.
