3D الثقافة يجعل من الصعب قياس وظيفة الخلوية ، وذلك باستخدام معيار المقاييس البيولوجية. يتيح هذا البروتوكول قياس النشاط الخلوي واللوميتيك دون معالجة عينات إضافية، باستخدام مستشعر الفلورسنت وقارئ اللوحة الدقيقة القياسي. ويتيح هذا البروتوكول عددا من التطبيقات الجديدة، بما في ذلك فحص العقاقير ذات الإنتاجية العالية.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن تبادل أجهزة الاستشعار الفلورسنت مع جهاز استشعار مختلف لقياس وظائف البروتيازات الأخرى أو الخلية. من المهم أن تخطط بعناية خارج التجربة مقدما، واستكمال جميع الحسابات لإعداد هيدروجيل، والإعداد جميع المعدات والكواشف لتقليل الخلايا الوقت في التعليق. للبدء، وإعداد وسائل الإعلام مع 1٪ الفحم جردت مصل البقر الجنين، واثنين من MM L-الجلوتامين، 10 وحدات لكل مل من البنسلين، و 10 ميكروغرام لكل مل من الستربتومايسين.
لا تستخدم فينول وسائل الإعلام الحمراء، التي لديها أكثر التداخل fluorescence. لجعل الضوابط الإيجابية، إضافة البكتيريا الكولاجين نوع واحد إلى وسائل الإعلام المقايسة في تركيزات 10 و 1000 ميكروغرام لكل مل. المقبل، وإعداد حل السلائف هيدروجيل عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب 1.5 مل.
تأكد من دوامة بعد إضافة كل مكون. ثم تقسيم الحل إلى أنابيب 1.5 مل متعددة لظروف مختلفة. لتغليف الخلايا في الهيدروجيل، أولاً قم بإعداد تعليق خلية واحدة عن طريق غسل طبق 10 سم من خلايا الورم الميلانيني A375 مع 10 مل من PBS.
ثم، إضافة 0.05٪ التربسين إلى الطبق، لتريبسينيزي الخلايا. احتضان الطبق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ثلاث دقائق. بعد الاحتضان، عد الخلايا مع قياس الهيموزيت.
بعد ذلك، الطرد المركزي حل الخلية في 314 مرات G لمدة ثلاث دقائق. استلهمت وسائل الإعلام والثقافة، والخلايا resuspend في المخزن المؤقت PBS في حوالي ثلاثة أضعاف الكثافة مغلفة النهائي. عد الخلايا مرة أخرى لضمان تركيز دقيق للخلايا.
ثم، إضافة الخلايا المعلقة في برنامج تلفزيوني إلى كل أنبوب من حل السلائف هيدروجيل وفقا لكثافة البذر المطلوبة، ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. بالنسبة للظروف التي يتم التحكم فيها، قم بإضافة برنامج PBS و الدوامة فقط. المقبل، ماصة 10 ميكرولترات من محلول السلائف هيدروجيل في منتصف كل بئر من العقيمة، أسود، جولة القاع 96 لوحة جيدا.
فحص بصريا وضع الهيدروجيل داخل الآبار. يمكن إعادة وضع الهيدروجيل غير المركز باستخدام طرف ماصة قبل البلمرة. لتبلمر محلول السلائف الهيدروجيل، يعرض اللوحة لضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 4 مللي واط لكل سنتيمتر مربع، لمدة ثلاث دقائق.
بعد ذلك، إضافة 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام المقايسة لجميع الآبار التي تحتوي على الخلايا المغلفة، و 150 ميكرولترات من محلول انزيم الكولاجيناز إلى آبار الضوابط الإيجابية. أضف 150 ميكروليترات من حاجز PBS إلى الآبار الخارجية للطبق لتقليل التبخر أثناء الحضانة. استخدم قارئ الصهقرة الدقيقة لقياس شدة الفلورسنت في اللوحة في ساعة الصفر ، على الفور بعد التغليف.
حدد بروتوكول لوحة 96 96 مع 494 نانومتر الإثارة، و 521 نانومتر أطوال موجية للانبعاثات. بعد ذلك، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة 18 ساعة. ثم إضافة الكواشف النشاط الأيضي في حجم واحد إلى 10 إلى نسبة حجم في بئر لجميع الظروف والضوابط.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ست ساعات. وأخيرا ، وقياس كثافة الفلورسنت من لوحة في 24 ساعة ، والتغليف وظيفة. حدد بروتوكول لوحة البئر المعتمة 96، مع 494 نانومتر استثارة، و521 نانومتر أطوال موجية للانبعاثات، لنشاط MMP.
لقياس النشاط الأيضي، حدد 560 نانومتر الإثارة، و 590 نانومتر أطوال موجات الانبعاثات. في هذه الدراسة، عند تعرض جهاز استشعار الفلوروجينيك للبروتيس المناسبة، يتم فصل quencher و Fluorophore، وزيادة الفلورسينس. قياسات الفلوريسنس من الهيدروجيل المحتضنة مع انزيم الكولاجين البكتيرية نوع واحد، وتبين أن أقل إشارة تم الكشف عن إنتاجها من قبل الضوابط السلبية، مع عدم وجود الكولاجيناز.
في حين تم إنتاج أعلى إشارة تم الكشف عنها بواسطة 1000 ميكروغرام لكل مل من الكولاجيناز أو أعلى، عندما تبدأ الإشارة في الهضبة. وكان نطاق العمل المحسوب من حوالي 0.16 إلى 474 ميكروغرام لكل مل من الكولاجيناز. كانت قراءات الفلوريسنس لخط خلايا الورم الميلانيني A375، المغلفة في مجموعة من الكثافات بعد التغليف مباشرة، منخفضة عبر كثافات البذر، ومشابهة للجل المسيطر بدون خلايا كما هو متوقع.
بعد 24 ساعة من التغليف، كان نشاط MMP متناسبًا بشكل مباشر مع كثافة البذر، وتدرج كثافات البذر عند أو أكثر من مليون خلية لكل مل، ضمن حدود نطاق العمل. وكانت قياسات النشاط الأيضي لخط الخلية A375، أيضا متناسبة بشكل مباشر مع كثافة البذر الخلية. عن طريق تطبيع نشاط MMP إلى النشاط الأيضي، لم يكن هناك فرق كبير في نشاط MMP لكل خلية في كثافات البذر أكبر من 2 مليون خلية لكل مل.
تقنيات الأنابيب المناسبة مهم. وهذا يشمل نصائح ما قبل التبول لتحقيق كميات دقيقة من الحلول اللزجة. أيضا، مركزة حل السلائف هيدروجيل داخل البئر، أمر بالغ الأهمية لتحقيق قياسات دقيقة من قبل قارئ لوحة.
لتحديد MMPs محددة التي تساهم في نشاط MMP يقاس هنا، يمكن استخدام مقايسات التعبير مثل لطخة الغربية أو PCR. يتطلب استخدام الخلايا الحية إجراء السلامة البيولوجية السليم، وتقنية معقمة، ومجلس وزراء السلامة البيولوجية. ضوء الأشعة فوق البنفسجية هو خطر، واستخدام درع لحماية المستخدم، ولا ننظر مباشرة في ضوء.
