3D культура затрудняет измерение клеточной функции с использованием стандартных биологических анализов. Этот протокол позволяет измерять клеточной и соматической активности без дальнейшей обработки образцов, используя флуоресцентный датчик и стандартный считыватель микропластиров. Этот протокол позволяет использовать ряд новых приложений, включая высокую пропускную способность скрининга лекарственных препаратов.
Кроме того, флуоресцентный датчик можно обменять с помощью другого датчика для измерения других протеаз или функций клеток. Важно тщательно спланировать эксперимент заранее, завершить все расчеты по подготовке гидрогеля, а также настроить все оборудование и реагенты, чтобы свести к минимуму время, которое клетки находятся в подвеске. Для начала подготовьте анализ средств массовой информации с 1%charcoal раздели фетальной сыворотки крупного рогатого скота, два мММ L-глутамин, 10 единиц на мл пенициллина, и 10 микрограмм на мл стрептомицина.
Не используйте фенол красные средства массовой информации, который имеет больше флуоресценции вмешательства. Чтобы сделать положительный контроль, добавьте бактериальный коллагеназный фермент типа один в средства анализа при концентрациях 10 и 1000 микрограммов на мл. Затем подготовьте раствор прекурсора гидрогеля, добавив реагенты в трубку 1,5 мл.
Убедитесь в том, чтобы вихрь после добавления каждого компонента. Затем разделите раствор на несколько трубок 1,5 мл для различных условий. Чтобы инкапсулировать клетки в гидрогелях, сначала приготовьте одноклеточную суспензию, помыв 10-сантиметровую тарелку клеток меланомы A375 с 10 мл PBS.
Затем добавьте в блюдо 0,05%трипсина, чтобы попробовать клетки. Инкубировать блюдо при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, в течение трех минут. После инкубации подсчитайте клетки с гемоцитометром.
Далее центрифуга клеточного раствора в 314 раз G в течение трех минут. Аспирировать культурные средства массовой информации и повторное распределение ячеек в буфере PBS примерно в три раза превышает окончательную инкапсулированную плотность. Подсчитайте клетки снова, чтобы обеспечить точную концентрацию клеток.
Затем добавьте подвешеные клетки в PBS к каждой трубке раствора прекурсора гидрогеля в соответствии с требуемой плотностью посева, и смешайте, трубя вверх и вниз. Для контролируемых условий, только добавить PBS и вихрь. Далее, пипетка 10 микролитров раствора прекурсора гидрогеля в середине каждой колодец стерильной, черной, круглого дна 96 хорошо пластины.
Визуально проинспектировать размещение гидрогеля внутри скважин. Нецентрированные гидрогели могут быть перемещены с помощью наконечника пипетки перед полимеризацией. Для полимеризации раствора прекурсора гидрогеля в течение трех минут подвергайте пластину ультрафиолетовому свету мощностью 4 милливатта на квадратный сантиметр.
Далее добавьте 150 микролитров анализаторов для всех скважин, содержащих инкапсулированные клетки, и 150 микролитров ферментного раствора коллагеназы в колодцы положительного контроля. Добавьте 150 микролитров буфера PBS во внешние скважины пластины, чтобы уменьшить испарение во время инкубации. Используйте считыватель микропластиц для измерения флуоресцентной интенсивности пластины в нулевой час, сразу же после инкапсуляции.
Выберите непрозрачный протокол пластины 96 хорошо с 494 нанометрового возбуждения, и 521 нанометров длин волн выбросов. Далее, инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа, в течение 18 часов. Затем добавьте реагенты метаболической активности при соотношении 1-10 томов к объему на колодец при всех условиях и контроле.
Инкубировать пластину в 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа, в течение шести часов. Наконец, измерьте флуоресцентную интенсивность пластины в течение 24 часов, после инкапсуляции. Выберите непрозрачный протокол пластины 96 хорошо, с 494 нанометров возбуждение, и 521 нанометров длины волн выбросов, для активности MMP.
Для измерения метаболической активности выберите 560 нанометров и 590 длин волн выбросов нанометров. В этом исследовании, при воздействии флюорогенного датчика на соответствующую протеазу, утоление и флюорофор разделены, и флуоресценция увеличивается. Измерения флуоресценции инкубированных гидрогел с бактериальным коллагеназным ферментом типа 1, показывают, что самый низкий обнаруженный сигнал был получен отрицательным контролем, без коллагеназы.
В то время как самый высокий обнаруженный сигнал был получен 1000 микрограмм на мл коллагеназы или выше, когда сигнал начинает плато. Расчетный рабочий диапазон составил от 0,16 до 474 микрограммов на мл коллагеназы. Показания флуоресценции для линии клеток меланомы A375, инкапсулированные в диапазоне плотности сразу после инкапсуляции, были низкими по плотности посева и похожи на контроль гелей без клеток, как ожидалось.
Через 24 часа после инкапсуляции активность MMP была прямо пропорциональна плотности посева, а плотность посева на уровне или более 1 миллиона клеток на мл, подпадают под пределы рабочего диапазона. Измерения метаболической активности клеточной линии A375 также были прямо пропорциональны плотности посева клеток. Путем нормализации активности MMP к метаболической активности, не было никакой существенной разницы в активности MMP на клетку при плотности посева более 2 миллионов клеток на мл.
Правильные методы пипетки имеет важное значение. Это включает в себя предварительно смачивания советы для достижения точных объемов вязких решений. Кроме того, центрирование раствора прекурсора гидрогеля в пределах хорошо, имеет решающее значение для достижения точных измерений считывателем пластин.
Для определения конкретных ПМП, способствующих измеренной здесь активности MMP, можно использовать анализы выражений, такие как западная помарка или ПЦР. Использование живых клеток требует надлежащей процедуры биобезопасности, асептической техники и биологического шкафа безопасности. УФ-излучение опасно, использовать щит для защиты пользователя, и не смотреть прямо в свет.
