3D kültür, standart biyolojik tahliller kullanarak hücresel fonksiyonu ölçmeyi daha da zorlaştırır. Bu protokol, floresan sensör ve standart bir mikroplaka okuyucu kullanarak, daha fazla numune işleme olmadan hücresel ve somatik aktivitenin ölçülmesini sağlar. Bu protokol, yüksek iş kadar uyuşturucu taraması da dahil olmak üzere bir dizi yeni uygulama sağlar.
Ayrıca, floresan sensör diğer proteazlar veya hücre fonksiyonlarını ölçmek için farklı bir sensör ile değiştirilebilir. Deneyi önceden dikkatlice planlamak, hidrojel hazırlığı için tüm hesaplamaları tamamlamak ve hücrelerin askıya alındığı zamanı en aza indirmek için tüm ekipmanları ve reaktifleri kurmak önemlidir. Başlamak için, % 1 kömür soyulmuş Fetal Sığır Serum, iki mM L-glutamin, penisilin mL başına 10 adet ve streptomisin mL başına 10 mikrogram ile tahkikat medya hazırlamak.
Daha fazla floresan paraziti olan fenol kırmızısı ortam kullanmayın. Pozitif kontroller yapmak için, mL başına 10 ve 1000 mikrogram konsantrasyonlarda istibak ortamına bakteriyel kollajenaz enzim tipi bir ekleyin. Daha sonra, 1,5 mL'lik bir tüpe reaktifler ekleyerek hidrojel öncül çözeltisini hazırlayın.
Her bileşenin eklenmesinden sonra girdap emin olun. Daha sonra farklı koşullar için çözeltiyi birden fazla 1,5 mL tüpe bölün. Hidrojellerde hücreleri kapsüllemek için, ilk PBS 10 mL ile A375 melanom hücrelerinin 10 cm çanak yıkayarak tek bir hücre süspansiyon hazırlamak.
Daha sonra, hücreleri trypsinize için, çanak% 0.05 tripsin ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit, üç dakika boyunca çanak kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücreleri hemositometre ile sayın.
Daha sonra hücre çözeltisini 314 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Kültür ortamını aspire edin ve PBS tamponundaki hücreleri son kapsüllenmiş yoğunluğun yaklaşık üç katı kadar yeniden askıya alın. Doğru bir hücre konsantrasyonu sağlamak için hücreleri tekrar sayın.
Daha sonra, gerekli tohumlama yoğunluğuna göre hidrojel öncül çözeltisinin her tüpüne PBS'deki askıda hücreleri ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Kontrollü koşullar için yalnızca PBS ve girdap ekleyin. Sonra, pipet 10 mikrolitre hidrojel öncül çözeltisi steril, siyah, yuvarlak dipli 96 kuyu plakaher kuyunun ortasına.
Hidrojellerin kuyuların yerleşimini görsel olarak inceleyin. Merkezsiz hidrojeller polimerizasyondan önce pipet ucu kullanılarak yeniden konumlandırılabilir. Hidrojel öncül çözeltisini polimerize etmek için plakayı santimetre kare başına 4 miliwatt'lık uv ışığına üç dakika boyunca maruz bırakın.
Daha sonra, kapsüllü hücreler içeren tüm kuyulara 150 mikrolitre ispon media ve pozitif kontrol kuyularına kollajenaz enzim çözeltisinin 150 mikrolitresini ekleyin. Kuluçka sırasında buharlaşmayı azaltmak için plakanın dış kuyularına 150 mikrolitre PBS tampon ekleyin. Plakanın floresan yoğunluğunu sıfır saatte ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın, hemen kapsülleme sonrası.
494 nanometre uyarma ve 521 nanometre emisyon dalga boylarında opak 96 kuyu plaka protokolünü seçin. Sonra, plakayı 37 derecede %5 karbondioksitle 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra tüm koşullar ve kontroller için iyi başına hacim oranı bir ila 10 hacim metabolik aktivite reaktifler ekleyin.
Plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit, altı saat boyunca kuluçkaya yatırın. Son olarak, 24 saat, kapsülleme sonrası plaka floresan yoğunluğunu ölçün. MMP aktivitesi için 494 nanometre uyarma ve 521 nanometre emisyon dalga boyları ile opak 96 kuyu plaka protokolünü seçin.
Metabolik aktiviteyi ölçmek için 560 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon dalga boylarını seçin. Bu çalışmada florojenik sensörün uygun proteaza maruz kalmasından sonra, sorgulayıcı ve florofor ayrılır ve floresan artar. Bakteriyel kollajenaz enzim tipi bir ile kuluçkahidrojellerin floresan ölçümleri, en düşük tespit edilen sinyalnegatif kontroller tarafından üretilen olduğunu göstermektedir, hiçbir kollajenaz ile.
Tespit edilen en yüksek sinyal, sinyal platoya başladığında, kollajenaz ın mL başına 1000 mikrogram veya üzeri ile üretilirken. Hesaplanan çalışma aralığı kollajenazmın mL başına yaklaşık 0,16 ila 474 mikrogram arasındaydı. A375 melanom hücre hattı için floresan okumaları, kapsülleme hemen sonra yoğunlukları bir dizi kapsüllenmiş, tohumlama yoğunlukları arasında düşük, ve beklendiği gibi hücreleri olmadan kontrol jelleri benzer.
Kapsüllemeden 24 saat sonra, MMP aktivitesi tohumlama yoğunluğu ile doğru orantılıydı ve mL başına 1 milyon hücreden fazla veya daha fazla tohumlama yoğunluğu çalışma aralığının sınırları içinde yer almaktadır. A375 hücre hattının metabolik aktivite ölçümleri de hücre tohumlama yoğunluğu ile doğru orantılıydı. MMP aktivitesini metabolik aktiviteye normalleştirerek, mL başına 2 milyon hücreden fazla tohumlama yoğunluklarında hücre başına MMP aktivitesinde anlamlı bir fark yoktu.
Uygun pipetleme teknikleri önemlidir. Bu viskoz çözümlerin doğru hacimleri elde etmek için önceden ıslatma ipuçları içerir. Ayrıca, kuyu içinde hidrojel öncül çözüm merkezleme, plaka okuyucu tarafından doğru ölçümler elde etmek için önemlidir.
Burada ölçülen MMP etkinliğine katkıda bulunan belirli MDP'leri tanımlamak için western blot veya PCR gibi ifade denemeleri kullanılabilir. Canlı hücrelerin kullanımı uygun biyogüvenlik prosedürü, aseptik teknik ve biyolojik güvenlik kabinesi gerektirir. UV ışığı tehlikelidir, kullanıcıyı korumak için bir kalkan kullanın ve doğrudan ışığa bakmayın.
