Wir danken Peter Staeheli zur Bereitstellung B6.A2G-Mx1 Mäusen und Semra Özcelik für technische Beratung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft über SFB829 und KN536 / 16 und der Köln Fortune-Programm / der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln unterstützt.

Ethik-Anweisung. Die Herstellung von epidermalen Schichten von geopferten Tiere erfolgt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Führer von Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen (Deutschland) durchgeführt. Die Studie wurde von LANUV NRW (Anzahl 8.84-02.05.20.13.018) zugelassen. 1. Vorbereitung der Instrumente und Kultur Medien <ol><li> Kulti epidermalen Schichten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose enthaltenden Glutamindipeptid, 10% FCS, 100 IE / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als &quot;DMEM&quot; bezeichnet). </li><li> Zur Herstellung von epidermalen Schichten sorgfältig aufzulösen Dispase II-Pulver (5 mg / ml) in PBS erhitzt (bis zu 37 ° C). Die Lösung wird durch ein 0,22 um Filter und ihn direkt für die Behandlung. </li><li> Für die Herstellung der gesamten epidermalen Halterungen 13, bereiten blockiert Buffer mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS. Substanzen ermöglichen, durch Inkubieren des Gemisches für mindestens 2 h bei RT auf einem Rotationsmischer aufzulösen. Bereiten auch 0,2% Tween 20 in PBS als Waschpuffer. Zur Fixierung vorzubereiten 3,4% und 4% Formaldehyd in PBS. </li><li> Für die Immunfärbung von Gefrierschnitten, bereiten Blockierungspuffer mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS. Zur Fixierung, bereiten 0,5% Formaldehyd in PBS. </li></ol> 2. Herstellung der epidermalen Schichten von Mäusehaut <ol><li> Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Rückenhaut für Infektionsstudien <ol><li> Legen Sie eine enthauptete Maus (1 bis 3 Tage nach der Geburt) in eine Dissektion Gericht und abgeschnitten Extremitäten und der Schwanz in der Nähe des Oberkörper, um eine effiziente Entfernung der Haut von der komplette Oberkörper zu ermöglichen. Während der Entfernung der Extremitäten, versuchen, die Einschnitte so klein wie möglich im Durchmesser zu halten. </li><li> Befestigen Sie den Oberkörper mit gekrümmten feinen Pinzette einnd sanft bewegen stumpfe Spitze Schere unter der Haut von kranial nach kaudal entlang der Rückseite, um die Haut vom Rumpf zu trennen. Slit die Haut entlang der Rückseite. </li><li> Für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA, ziehen Sie die komplette Haut vor den Oberkörper mit einer Pinzette, um das Gewebe und die stumpfe Spitze Schere zu beheben, um den Oberkörper abstoßen. Für die Herstellung von Gefrierschnitten oder ganzen Halterungen nehmen Sie nur Teile der Rückenhaut. </li><li> Hacken Sie die Rückenhaut mit einem Skalpell in 1-2 Stücke von ca. 10 x 10 mm. Setzen Sie die Stücke in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ~ 1 ml sterilem PBS. Stellen Sie sicher, dass die dermale Seite der Bodenflächen. </li><li> Ersetzen PBS mit 1,5 ml Dispase II (5 mg / ml PBS) und Inkubation für entweder 30 min bei 37 ° C (für Gesamtpräparate) oder O / N bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis als intaktes Blatt mit einer Pinzette, um die darunter liegenden Dermis und die anderen Pinzette zu beheben, um die Epidermis zu heben. Verwenden Sie ein Fernglas, um diesen Schritt zu machen easy. Übertragen Sie die epidermale Schicht in DMEM mit seinen basalen Seite nach unten. Verwenden Sie die Blätter sofort für Infektionsversuche. HINWEIS: Verwenden Sie die Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Haut vor allem für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA. Wegen ihrer Zerbrechlichkeit, ist die Herstellung von infizierten Platten für Kryoschnitte oder Gesamtpräparate weniger geeignet. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Epidermis von Erwachsenen Schwanzhaut für Infektionsstudien <ol><li> Euthanize die Mäuse im Alter von 1-3 Monaten durch zervikale Dislokation. Nehmen Schwanz statt Rückenhaut, da die lang eingebettet Haarfollikel auf der Rückseite beeinträchtigen Trennung von intakten epidermalen Schichten. Schneiden Sie den Schwanz von Mäusen geopfert und schlitzte es der Länge nach mit einem Skalpell. </li><li> Ziehen Sie weg der Haut vom Knochen und hacken sie mit einem Skalpell in Stücke von etwa 5 x 5 mm. Legen Sie bis zu 4 Stück in einem gut und fahren Sie mit der Inkubation in Dispase II wie unter 2.1.5 beschrieben, HINWEIS: Verwenden Sie für Erwachsene tail Haut zu Gefrierschnitten oder ganzen Lager vorzubereiten. Alternativ zur unmittelbaren Verwendung kann Schwänzen gelagert oder für etwa 24 h bei 4 ° C, ohne signifikante Infektionseffizienz transportiert werden. Wenn Schwänze sind bis zu 48 Stunden aufbewahrt, könnte epidermalen Schichten kaum mit HSV-1 infiziert. </li></ol></li><li> Dissoziation der Epidermis für die FACS-Analyse Hinweis: Der Nachweis von Oberflächenprotein-Expression durch FACS-Analyse erfordert geeignete Zelldissoziation Techniken, die nicht die Zelloberfläche und das Protein von Interesse schaden. <ol><li> Inkubieren neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite auf 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Stoppen Sie die Inkubation durch Zugabe von 3 ml DMEM. Distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in der 6-Well-Platte, so dass die Keratinozyten erhalten gelöst. Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 malimmer mit frischem DMEM. Hinweis: Diese Dissoziation Verfahren ist angebracht, Nectin-1 auf der Oberfläche der Keratinozyten zu erkennen. </li><li> Alternativ inkubiere die epidermalen Blätter auf enzymfreien Zelldissoziationslösung (CDS) für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C. Inkubieren Sie weitere 15 min bei RT, um sanft spülen die Keratinozyten durch Pipettieren von CDS auf und ab. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie den Spülvorgang 3 mal mit frischem DMEM. Hinweis: Diese Dissoziation ist geeignet, um die Oberflächenexpression von HVEM zu erkennen. Der Nachteil der CDS-Lösung ist, dass weniger Zellen als bei rekombinante Trypsin-basierten Zelldissoziationslösung dissoziiert. Zusätzlich zur Oberflächen nach Dissoziation der infizierten epidermalen Schichten mit rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung Expression kann nukleare oder cytoplasmatische Expression wie ICP0-Expression durch FACS analysiert werden. </li></ol></li><li> Dissoziation von Epidermis-Keratinozyten oder ex isolierenRNA-Darm-Trakt <ol><li> Gesetzt neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite in Richtung der Unterseite der Schale, die 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung enthält. Inkubation für 30 min bei RT. In 3 ml DMEM und distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in die Schüssel. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal mit frischem DMEM. Verwenden Sie diese Zellsuspension in RNA oder zur Kultur primären murinen Keratinozyten zu extrahieren. </li></ol></li></ol> 3. Die Infektion von epidermalen Schichten mit HSV-1 <ol><li> Es wird eine Lösung von HSV-1 Stamm 17 Gew 11 in nicht weniger als 500 &amp; mgr; l DMEM-Medium ersetzt und die durch die Viruslösung auf dem die epidermalen Schichten schwimmen. Dieser Zeitpunkt wird als Zeitpunkt 0 12 definiert. Führen Infektion eines epidermalen Schicht in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C. Die Berechnung der Virustiter über die geschätzte Anzahl basierendvon Zellen in der Basalschicht pro epidermale Schicht (etwa 2 x 10 5 Zellen pro 5 x 5 mm Blech). </li><li> Infizieren mit HSV-1 mit ungefähr 100 Plaque-bildende Einheiten (PFU) / Zelle und ersetzen das virushaltige Medium durch DMEM bei 1 h pi HINWEIS: Bei epidermalen Schichten von Neugeborenen Haut, bedenken Sie, dass Blätter beginnen, während der Inkubation zu distanzieren. </li></ol> 4. Visualisierung der infizierten Zellen <ol><li> Epidermal Whole Halterungen 13 <ol><li> Fix epidermalen Schichten mit 3,4% Formaldehyd entweder für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C. Zwei Mal mit PBS waschen und blockieren mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS 1 h bei RT 14. </li><li> Inkubieren Sie die Platten O / N mit Maus-Anti-ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) 15 verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer bei RT. Um die Intermediärfilament Netzwerk visualisieren inkubieren gleichzeitig mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus Keratin 14 (100 ng / ml). </li><li> Während 4 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-0,2% Tween 20 waschen 4-5 mal. Inkubieren O / N mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml), AF555-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG (1 ug / ml) und DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol) (100 ng / ml) in Blockierpuffer bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen mit PBS-0,2% Tween 20 für 4 h bei RT. Berg epidermalen Schichten mit ihren basalen Seite auf einem Objektträger, einbetten in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen. </li></ol></li><li> Epidermal Kryoschnitte <ol><li> Erwachsenen epidermalen Schichten wurden in 4% Formaldehyd in PBS für 20 min bei RT fixiert und 2 mal mit PBS gewaschen. Einbetten festen Blätter in Gewebegefriermedium und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Geschnitten 8-10 um-Schnitte mit einer Kryomikrotom. </li><li> Befestigen Sie die Profile wieder mit 0,5% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT, wäscht 2 mal mit PBS, Block mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS für 30 min bei RT und dann für 60 min mit m FleckOUSE Anti ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) 15 verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer, gefolgt von 3 Mal Waschen mit dem Blockierungspuffer. </li><li> Dann Inkubieren mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml) und DAPI (100 ng / ml) in Blockierungspuffer für 45 Minuten bei RT und 3 x waschen. Betten Sie Abschnitte in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wenn epidermalen Schichten der Haut von Erwachsenen aus C57BL / 6 sind mit HSV-1 infiziert bei etwa 100 PFU / Zelle beobachten wir Infektion in fast allen Zellen der Basalschicht der interfollikuläre Epidermis während geringere Virusdosen korrelieren mit weniger infizierten Zellen und einer langsameren Fortschritt der Infektion. Im allgemeinen Haarfollikel zeigen eine variable Anzahl von infizierten Zellen; während die meisten der eher klein Keratinozyten säumen die Entwicklung Haarfollikel infiziert sind, wird nur ...

Herpes-simplex-Virus (HSV) können eine Reihe von Erkrankungen bei Menschen von leichten unkompliziert mukokutane Läsionen zu lebensbedrohlichen Infektionen. HSV Typ 1 (HSV-1) wird überwiegend mit orofazialen Infektionen und Enzephalitis assoziiert, während HSV Typ 2 (HSV-2) eher verursacht Genitalinfektionen 1. Zwar gibt es deutliche Fortschritte im Verständnis, wie HSV tritt in Zellen in Kultur initiiert und produziert Infektion Virusnachkommen, wissen wir wenig über das virale Invasion Weg (e) in das Gewebe auf zellulärer Ebene 2. Bei Studien von HSV Haut- oder Schleimhautinfektionen, Mäuse, haben Kaninchen und Meerschweinchen als Tiermodelle verwendet. Hautinfektion wurde durch intradermale Injektion oder durch Kratzen der Haut in Gegenwart von Virus etabliert und die Entwicklung der Krankheit wurde mit der Virusproduktion korreliert. Diese Verfahren beigetragen, verschiedene Aspekte der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen, und werden verwendet, um antivirale Medikamente zu bewerten. Um HSV-Infektion am tissu studierene Ebene organotypischen Modelle der menschlichen Haut angewendet wurden. Als die Infektionsrate in diesen Floßkulturen beschränkt ist, nur eine begrenzte Anzahl von Studien, die Infektion, die Virusausbreitung und die Auswirkungen der antiviralen Komponenten veröffentlicht 3-6. Um zelluläre Determinanten, die während der HSV-1-Infektion in der intakten Epithels eine Rolle spielen, zu charakterisieren, haben wir ein Protokoll für die Ex-vivo-Infektionsstudien von murinen Epidermis 7. Haut von Neugeborenen oder von den Schwänzen von erwachsenen Mäusen hergestellt. Da HSV-1 kann er die vollständige Hautproben, die in virushaltige Medium eingetaucht wurden nicht infizieren, die Epidermis von der Dermis getrennt wir durch Behandlung Dispase II. Nach dem Schwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium kann infizierte Zellen in der epidermalen Basalschicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (pi) 7 visualisiert werden. Um die Einleitung der Infektion in einzelnen Zellen vor der viralen Replikation eine Visualisierungnd Virusproduktion, gebeizt wir mit einem Antikörper gegen die infizierten Zellprotein 0 (ICP0), die eine der ersten Proteine ​​während der HSV-1-Infektion exprimiert wird. Die zelluläre Lokalisation von ICP0 durchläuft verschiedene Phasen während der frühen Infektion. Während ICP0 ist in Kern Foci vorliegenden während einer frühen Phase der viralen Genexpression, Relokalisierung ICP0 zum Zytoplasma zeigt eine spätere Phase der Infektion 8. Wir nutzten die Ex-vivo-Infektionsassay der epidermalen Schichten aus verschiedenen Mausmodellen, um die mögliche Rolle der verschiedenen zellulären Faktoren während der Infektion zu testen. Um die Auswirkungen von Rac1 als Schlüsselregulator der Aktindynamik adressieren, infizierten wir die Epidermis von Mäusen mit einem Keratinozyt-spezifische Deletion des Gens rac1 9. Dieses Modell erlaubt es, die Auswirkungen der mangel Rac1 auf den Wirkungsgrad der HSV-1-Infektion in epidermalen Keratinozyten Schichten zu studieren. Der Vergleich zu infizierten Epidermis der Steuerwurfwiedervealed keinen signifikanten Unterschied, was anzeigt, dass die Abwesenheit von Rac1 hatte keine Wirkung auf die Einleitung der Infektion in der Basalschicht der Epidermis 7. Die Verwendung weiterer Mausmodellen konnten wir Adresse, die zellulären Rezeptoren vermitteln den Eintritt in die Epidermis. Infizieren epidermalen Schichten entweder Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen mit HSV-1 zeigte, dass das anfängliche Eindringen des Virus in Gewebe hängt stark von der Gegenwart von Nectin-1 10. Darüber hinaus sind unsere Ergebnisse zeigen, dass HVEM auch als Rezeptor in murine Epidermis weniger effizient zu bedienen, auch wenn als Nectin-1 10. Um die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in den Schichten der Epidermis zu adressieren visualisieren wir ICP0 Expression in Gewebeschnitten und epidermalen Gesamtpräparate (Abbildung 1). In Kryoschnitten von kompletten Haut, werden keine ICP0-exprimierenden Zellen detektiert (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu Kryoschnitte der epidermalen Schichten zeigen zytoplasmatischenICP0 Ausdruck in der basalen Schicht bereits nach 3 Stunden pi (Abbildung 1). Zu späteren Zeitpunkten, virale Verbreitung in Schichten suprabasale visualisiert werden. Die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in der Basalschicht leicht in epidermalen Gesamtpräparate (Figur 1) folgen. Bei der Infektion mit HSV-1 mit 100 PFU / Zelle wurden etwa 50% der basalen Keratinozyten in der Epidermis zeigen interfollikuläre ICP0 Expression bei 1,5 hr pi Zu diesem Zeitpunkt die meisten infizierten Zellen exprimieren Kern ICP0. Die Relokalisierung ICP0 in das Cytoplasma, das einen späteren Stadium der frühen Genexpression ist in nahezu allen Zellen in 3 h pi (Figur 1) vorhanden ist. Diese Modi auf ex vivo HSV-1-Infektion zu visualisieren infizierten Zellen über eine starke Assay zur Bestimmung der Wirkung von Inhibitoren oder gelöschter / mutierten zellulären Komponenten auf die virale Eintritt und die Ausbreitung im Gewebe zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966047</td><td>needed for cultivation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>dispase II powder</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>has to be solved in heated PBS</td></tr><tr><td>enzyme-free cell dissociation solution</td><td>Sigma</td><td>C5914</td><td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>TrypLE select cell dissociation solution</td><td>Life Technologies</td><td>12563-029</td><td>needed for dissociation of epidermal sheets</td></tr><tr><td>chelex 100 resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td></tr><tr><td>gelatin from cold water fish skin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td></tr><tr><td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>A-21429</td><td>used as secondary antibodies</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (conc.: 0.1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>36670</td><td>used to counterstain the nucleus</td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

Um seine menschlichen Wirt eingeben, müssen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) die Barriere von Schleimhäuten, Haut oder Hornhaut zu überwinden. HSV-1 Ziele Keratinozyten während der anfänglichen Eingabe und stellt eine Primärinfektion im Epithel, die durch latente Infektion von Neuronen folgt. Nach Reaktivierung können Viren deutlich an Schleimhaut Websites, die als Hautbläschen oder Schleimhautgeschwüre angezeigt zu werden. Wie HSV-1 dringt in Haut oder Schleimhaut und erreicht seine Rezeptoren ist wenig bekannt. Um die Invasion Route der HSV-1 in epidermale Gewebe auf zellulärer Ebene zu untersuchen, haben wir ein ex vivo-Infektionsmodell von murinen Epidermis, die den Ort der primären und rezidivierenden Infektion in der Haut darstellt. Der Test umfasst die Vorbereitung der Mäusehaut. Die Epidermis von der Dermis durch Dispase II Behandlung getrennt. Nach dem Aufschwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium wird das Gewebe fixiert und Infektion kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch visualisiertFärbung infizierter Zellen mit einem Antikörper gegen HSV-1-immediate early protein ICP0. ICP0-exprimierenden Zellen kann in der basalen Keratinozyten-Schicht bereits bei 1,5 Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Mit längeren Zeiten der Infektion werden infizierte Zellen in Suprabasalschichten nachgewiesen, was anzeigt, dass die Infektion nicht auf die basalen Keratinozyten beschränkt, sondern das Virus verbreitet sich auf andere Schichten in dem Gewebe. Verwendung epidermalen Schichten von verschiedenen Mausmodellen erlaubt die Infizierungsprotokoll Bestimmung der Beteiligung von zellulären Komponenten, die zu HSV-1-Invasion im Gewebe beitragen. Darüber hinaus ist der Test geeignet, um Inhibitoren in Gewebe, das mit den ersten Eintrag Schritte stören, Zell-zu-Zell-Ausbreitung und die Virusproduktion zu testen. Hier beschreiben wir die ex vivo Infektion Protokoll im Detail und mit Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen präsentieren unsere Ergebnisse.

Die Aufgabe des Verfahrens ist es, epidermalen Blätter in dem HSV-1 kann von der basalen Schicht eindringen vorzubereiten. Der entscheidende Schritt ist die Trennung der Epidermis von der Dermis durch Dispase II-Behandlung, die in Abhängigkeit von der Mausstamm, angepasst werden muss. Die Konzentration von Dispase II kann 2,5 bis 5 mg / ml, und die Zeit der Inkubation von 20 bis 45 min liegen. Die Färbung der Intermediärfilamente Protein Keratin 14 ermöglicht leicht vorherzusagen, ob der basalen Epidermis infiziert...

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Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K Aufrufe.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Serie: Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

Neurowissenschaften

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA Elektroporation zur Modulation der Autophagie bei Herpes Simplex Virus Typ 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a seroprevalence that ranges from 60-90% worldwide, the Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) commonly causes mucocutaneous lesions of the orofacial region which also manifest as lesions and infection-associated blindness. While current antiviral drugs are effective, emergence of resistance and persistence of toxic side-effects necessitates development of novel antivirals against this ubiquitous pathogen. Although in vitro assessment provides some functional data regarding an emerging antiviral, they do not demonstrate the complexity of ocular tissue in vivo. However, in vivo studies are expensive and require trained personnel, especially when working with viral agents. Hence ex vivo models are efficient yet inexpensive steps for antiviral testing. Here we discuss a protocol to study infection by HSV-1 using porcine corneas ex vivo and a method to treat them topically using existing and novel antiviral drugs. We also demonstrate the method to perform a plaque assay using HSV-1. The methods detailed may be used to conduct similar experiments to study infections that resemble the HSV-1 pathogen.

We describe the use of a porcine cornea to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Porcine Hornhautgewebe Explant, um die Wirksamkeit von Herpes Simplex Virus-1 Antiviralen zu untersuchen

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

siRNA-Based Inhibition of Autophagy in Herpes Simplex Virus-Infected Immature Dendritic Cells

Source: D&#252;thorn, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60190">siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a small interfering RNA (siRNA)-based technique to interfere with autophagic flux. A siRNA targeting FIP200 mRNA is introduced into monocyte-derived immature dendritic cells (iDCs) using electroporation, causing the knockdown of FIP200 expression and leading to the inhibition of nuclear lamin disruption via autophagy. Upon adding herpes simplex virus (HSV), the nuclear egress of viral progeny is inhibited due to the absence of lamin disruption via autophagic flux.

siRNA-basierte Hemmung der Autophagie in Herpes-simplex-Virus-infizierten unreifen dendritischen Zellen

Monocyte-derived DCs were generated from leukapheresis products of healthy donors. For this, a positive vote from the local ethics committee has been ...