Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie oft Plasmid-DNA auf verschiedene Bakterien verteilt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch die Reduzierung des Hintergrunds kleine Unterschiede in der Konjugationsfrequenz mit einer hohen Auflösung erkennen können. Demonstriert wird das Verfahren kosuke Yanagiya, ein Student aus meinem Labor.
Um die Konjugationshäufigkeit nach wahrscheinlichster Zahl zu berechnen, filtern Sie einen Milliliter aus einer Übernacht-Spenderkultur mit einem Milliliter aus einer Übernacht-Empfängerkultur für 45 Minuten bei 30 Grad Celsius, wie gerade gezeigt. Während die Co-Kultur inkubiert, verdünnen Sie seriell die ursprünglichen Spender- und Empfängerkulturen für die Beschichtung in Dreifacharbeit auf Spender Luria Brühe, oder LB, plus Kanamycin, oder Empfänger LB plus Gentamycin-Platten für eine zweitägige Kultur bei 30 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, resuspendieren Sie die Kultur auf dem Filter in sterilem LB enthält Kanamycin und Gentamycin für serielle Verdünnung in einer 96-Well-Zellkulturplatte in Quadruplikat.
Zählen Sie nach zwei Tagen bei 30 Grad Celsius manuell die koloniebildenden Einheiten oder KBE auf die Spender- und Empfängeragarplatten und die Anzahl der Brunnen, in denen die Transkonjuganten durch Lichtmikroskopie wachsen. Um die wahrscheinlichste Zahl und deren Abweichung zu berechnen, öffnen Sie das MPN-Berechnungsprogramm. Geben Sie den Namen und das Datum des Experiments, die Anzahl der Testreihen und die maximale Anzahl von Verdünnungen in Zeile sieben des Programmblatts der Tabellenkalkulationsdatei ein.
Geben Sie in den automatisch erstellten Eingabedatentabellen die Formel in der Spalte Verdünnungsfaktor D, 0,01 im Volumen in Milliliter oder GW-Spalte und vier in der Spalte Anzahl der Rohre N ein. Geben Sie die Anzahl der Brunnen ein, in denen die Transkonjuganten bei jeder Probenverdünnung gewachsen sind, und klicken Sie auf Berechnungsergebnisse, um die Ergebnisse als wahrscheinlichste Anzahl pro Milliliter und die oberen und unteren 95%-Vertrauensgrenzen zu erhalten. Dividieren Sie dann die Anzahl der Transkonjuganten durch die Anzahl der Spender- und Empfängerkolonien, die Einheiten pro Milliliter bilden, um die Konjugationshäufigkeit der Plasmide zu berechnen.
In diesem repräsentativen Experiment erhöhte sich die Konjugationshäufigkeit beider Plasmide bei höheren Rührraten mit einem maximalen Unterschied in der Konjugationshäufigkeit zwischen Null und 400 U/min für Kulturen, die in das pBP136:gfp-Plasmid eingeführt wurden, und zwischen null und 200 U/min für Kulturen, die in das pCAR1:gfp-Plasmid eingeführt wurden. Um die Dichte der Empfängerzellen zu bestimmen, die erforderlich sind, um die Wahrscheinlichkeit der Konjugation zu vergleichen, wurden Paarungstests mit unterschiedlichen Spender- und Empfängerdichten durchgeführt. In diesem repräsentativen Experiment wurden pBP136:gfp Transkonjugants in 100% der Brunnen nachgewiesen, die ein mal 10 bis die dritte KBE des Spenders und ein mal 10 bis fünfmal 10 bis die siebte KBE des Empfängers und solche mit einem mal 10 bis der zweiten KBE des Spenders und ein mal 10 bis 10 bis zur siebten KBE des Empfängers enthielten. , was darauf hinweist, dass die Zelldichte zu hoch war.
Die Paarung von Assays mit 10 KBE des Spenders und 10 bis zum sechsten oder 10. bis zur fünften KBE des Empfängers führte jedoch zu einer verringerten Anzahl transkonjuganter positiver Brunnen. So wurde vorhergesagt, dass 10 bis die fünfte KBE des Empfängers für die Paarung mit einer einzigen Spenderzelle erforderlich sein sollte. Die Paarungs-Assays mit pCAR1:gfp bei unterschiedlichen Dichten von Spender- und Empfängerstämmen zeigten ähnliche Befunde, obwohl die Prozentsätze der transkonjuganten positiven Brunnen insgesamt viel niedriger waren als die von pBP136:gfp.
Unter der Annahme, dass spender- und Empfängerzellen sich ähnlich anheften können, war die Wahrscheinlichkeit einer Konjugationsinitiation für den pCAR1-Spender geringer als für den pBP136-Spender. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde geschätzt, dass 10 bis die siebte KBE des Empfängers für eine einzelne Spenderzelle erforderlich war, die nach FACS sortiert wurde. Nach Zählung der Anzahl der transkonjuganten positiven Brunnen wurde der Prozentsatz der transkonjuganten positiven Brunnen für pBP136:gfp als größer als der für pCAR1:gfp bestimmt, was einen mehr als 36-fachen Unterschied in der Wahrscheinlichkeit einer von einem Spender initiierten Konjugation zwischen diesen beiden Plasmiden aufzeigte.
Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die bakteriellen Mischungen immer sorgfältig zu verdünnen.
