Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie sur la fréquence à quelle fréquence l’ADN plasmide peut se propager parmi différentes bactéries. Le principal avantage de cette technique est qu’en réduisant l’arrière-plan, nous pouvons détecter de petites différences dans la fréquence de conjugaison avec une haute résolution. Kosuke Yanagiya, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour calculer la fréquence de conjugaison par le nombre le plus probable, filtrez le compagnon d’un millilitre d’une culture de donneur de nuit avec un millilitre d’une culture de destinataire de nuit pendant 45 minutes à 30 degrés Celsius, comme juste démontré. Pendant que la co-culture est en incubation, diluer en série les cultures originales du donneur et du receveur pour le placage en triplicate sur le bouillon luria donneur, ou LB, plus la kanamycine, ou le receveur LB plus plaques de gentamycine pour une culture de deux jours à 30 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, resuspendez la culture sur le filtre dans le LB stérile contenant la kanamycine et la gentamycine pour la dilution périodique dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits dans le quadruplicate.
Après deux jours à 30 degrés Celsius, comptez manuellement les unités de formation des colonies, ou OVFC, sur les plaques d’agar des donneurs et des receveurs et le nombre de puits dans lesquels les transconjugants poussent par microscopie légère. Pour calculer le nombre le plus probable et son écart, ouvrez le programme de calcul MPN. Entrez le nom et la date de l’expérience, le nombre de la série de tests et le nombre maximal de dilutions dans la rangée sept de la feuille de programme du fichier de feuille de calcul.
Dans les tableaux de données d’entrée produits automatiquement, entrez la formule dans la colonne D du facteur de dilution, 0,01 dans le volume en millilitres ou colonne GW, et quatre dans le nombre de tubes N colonne. Entrez le nombre de puits dans lesquels les transconjugants ont augmenté à chaque dilution de l’échantillon et cliquez sur calculer les résultats pour obtenir les résultats comme le nombre le plus probable par millilitre, et les limites supérieures et inférieures de confiance de 95 %. Divisez ensuite le nombre de transconjugants par le nombre d’unités de formation des donneurs et des receveurs par millilitre pour calculer la fréquence de conjugaison des plasmides.
Dans cette expérience représentative, la fréquence de conjugaison des deux plasmides a augmenté à des taux d’agitation plus élevés avec une différence maximale dans la fréquence de conjugaison observée entre zéro et 400 RPM pour les cultures introduites au plasmide pBP136:gfp, et entre zéro et 200 RPM pour les cultures qui ont été introduites au plasmide pCAR1:gfp. Afin de déterminer la densité des cellules receveurs nécessaires pour comparer la probabilité de conjugaison, des analyses d’accouplement ont été effectuées avec différentes densités de donneurs et de receveurs. Dans cette expérience représentative, des transconjugants pBP136:gfp ont été détectés dans 100% des puits contenant une fois 10 à la troisième CFU du donneur et une fois 10 à la cinquième à une fois 10 au septième CFU du receveur, et ceux avec une fois 10 à la deuxième CFU du donneur et une fois 10 à la sixième à 10 à la septième CFU du receveur , indiquant que la densité cellulaire était trop élevée.
Les analyses d’accouplement avec 10 CFU de donneur et 10 à la sixième ou 10 à la cinquième CFU du destinataire, cependant, ont eu comme conséquence un nombre diminué de puits positifs transconjugants. Ainsi, 10 à la cinquième CFU du receveur a été prévu pour être nécessaire pour l’accouplement avec une seule cellule de donneur. Les analyses d’accouplement avec pCAR1:gfp à différentes densités de souches de donneurs et de receveurs ont démontré des résultats similaires, bien que dans l’ensemble les pourcentages de puits positifs transconjugants étaient beaucoup plus faibles que ceux de pBP136:gfp.
En supposant que les cellules du donneur et du receveur puissent s’attacher les unes aux autres de la même façon, la probabilité d’initiation à la conjugaison pour le donneur pCAR1 était inférieure à celle du donneur pBP136. Sur la base de ces résultats, on a estimé que 10 à la septième CFU du receveur était nécessaire pour une seule cellule donneuse triée par FACS. Après avoir compté le nombre de puits positifs transconjugants, le pourcentage de puits positifs transconjugants pour pBP136:gfp a été déterminé comme plus grand que celui de pCAR1:gfp, démontrant une différence plus de 36 fois dans la probabilité de conjugaison initiée par le donneur entre ces deux plasmides.
Tout en essayant la procédure, il est important de se rappeler de toujours diluer les mélanges bactériens avec soin.
