Cyanobakterien sind ein wichtiges Phylum von photosynthetischen Mikroben, die zunehmend als nützliche Plattformen für synthetische Biologie und erneuerbare Biotechnologie-Anwendungen anerkannt werden. Daher ist es wichtig, robuste Techniken zu entwickeln, um das Design, das Klonen und die Einführung heterologer DNA in verschiedene cyanobakterielle Arten zu vereinfachen. Diese Technik zeigt also eine etablierte Methode namens Konjugation oder triparentale Paarung zur Einführung von DNA in cyanobakterielle Arten, die nicht natürlich transformierbar sind.
Die Konjugation wurde erfolgreich in einer Vielzahl von cyanobakteriellen Stämmen von Einzelzell- bis zu mehrzelligen fadenförmigen Arten durchgeführt. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, achten Sie bitte darauf, sowohl Ihre Cyanobakterien als auch Ihre E.coli-Stämme mit Vorsicht zu behandeln. Zentrifugieren Sie z. B. nicht über den im Protokoll angegebenen Werten und wirbeln Sie nicht.
Mischen von Bakterien und Cyanobakterien kann seltsam für Erstanwender erscheinen. Wir hoffen, dass wir durch die Demonstration des Konjugationsprozesses dazu beitragen werden, dies zu klären. Wählen Sie nach dem Bau der Baugruppen der Ebene 1 einen geeigneten Pegel-T-Akzeptorvektor aus.
Wählen Sie einen geeigneten Endlink aus, um das drei Primende der endgültigen Ebene 1-Baugruppe auf das Level-T-Backbone zu ligte. Um eine oder mehrere Baugruppen der Ebene 1 in Ebene T zusammenzustellen, bereiten Sie einen Reaktionsmix mit PBI1 und dem erforderlichen Endlinkvektor vor. Richten Sie das Thermocycler-Programm ein und fahren Sie entsprechend dem Manuskript fort.
Wachsen Sie am ersten Tag die cyanobakterielle Kultur, indem Sie eine neue Kultur von Synechocystis PCC 6803 oder Synechococcus elongatus UTEX 2973 aufbauen. Mit einer hitzesterilen Schleife die Zellen von der axtischen BG-11 Agarplatte kratzen und in einen 100 Milliliter Konuskolben geben, gefüllt mit 50 Millilitern frischem BG-11-Medium bis zur Unheil. Legen Sie den Kolben in einen schüttelnden Inkubator mit Beleuchtung, um die Synechocystis PCC 6803 Zellkulturen bei 30 Grad Celsius bei 100 U/min zu züchten.
Für Synechococcus elongatus UTEX 2973, wachsen die Zellkulturen bei 40 Grad Celsius bei 100 RPM. Zeichnen Sie nach ein bis zwei Tagen einen Milliliter der Zellkultur und messen Sie auf einem Spektralphotometer. Die Absorption bei OD 750 erreicht 0,5 bis 1,5.
Am zweiten Tag impfen Sie einen MC1061 E.coli-Helferstamm, der die Vektoren PRK24 und PRL528 in fünf Millilitern LB-Medium mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter und Chloramphenicol in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Wachsen Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem Schüttel-Inkubator. Dann impfen Sie fünf Milliliter LB-Medium mit geeigneten Antibiotika mit der E.coli-Kultur, die den Frachtvektor der Ebene T trägt.
Wachsen Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem zitternden Brutkasten. Zentrifugieren Sie am dritten Tag den Helfer und die Ladung E.coli über Nacht bei 3.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
Waschen Sie die Pellets, indem Sie fünf Milliliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten und Zentrifugen pfeifen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um Restantibiotika aus der Nachtkultur zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche das Zellpellet in der Hälfte des Volumens des LB-Mediums des ursprünglichen Kulturvolumens wieder aufhängen. Dann 450 Mikroliter der Helfersorte mit 450 Mikrolitern der Ladungsdehnung in einem Zwei-Milliliter-Rohr kombinieren und bei Raumtemperatur verlassen. Als nächstes bereiten Sie die cyanobakterielle Kultur vor, indem Sie einen Milliliter cyanobakterielle Kultur bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren.
Dann entsorgen Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Zellpellet zu stören. Waschen Sie das Pellet viermal, indem Sie frisches BG-11 Medium des gleichen Anfangsvolumens hinzufügen. Fügen Sie 900 Mikroliter der gewaschenen cyanobakteriellen Kultur zu 900 Mikroliterdern der kombinierten E.coli-Stämme in einer Zwei-Milliliter-Röhre hinzu.
Mischen Sie die Kulturen, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten für Synechocystis PCC 6803 oder zwei Stunden für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
1,6 Milliliter des Überstandes entfernen und das Pellet im restlichen Überstand wieder aufhängen. Legen Sie einen 0,45 Mikron Membranfilter ohne Antibiotika auf eine LB BG-11 Agarplatte. 200 Mikroliter der E.coli/Cyanobakterienkultur auf der Membran vorsichtig mit einem sterilen Streuer oder einer sterilen gebogenen Spitze verteilen.
Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und legen Sie die Platte 24 Stunden lang in einen beleuchteten Inkubator. Übertragen Sie die Membran nach 24 Stunden sorgfältig mit Flammensterilisationszangen auf eine frische BG-11-Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, um sie für den Ladungsvektor auszuwählen. Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und brüten Sie unter den gleichen Bedingungen wie bisher, bis Kolonien auftreten.
Kolonien erscheinen in der Regel nach 7-14 Tagen für Synechocystis PCC 6803 und 3-7 Tage für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Um Konjuganten auszuwählen, wählen Sie mit einem hitzesterilen Impfstab mindestens zwei einzelne Kolonien aus der Membran aus und streifen auf eine neue BG-11-Agarplatte mit geeigneten Antibiotika. Dann impfen Sie einen Streifen cyanobakterieller Kultur in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mit fünf Millilitern LB-Medium und brüten bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 U/min in einem Schüttelinkubator.
Die klare Kultur bestätigt das Fehlen einer E.coli-Kontamination. Wählen Sie nach einer ausreichenden Wachstumsphase von sieben Tagen einzelne axtische Kolonien aus, um flüssige Kulturen für die langfristige Kryolagerung oder nachfolgende Experimente einzurichten. In dieser Studie wurde der Workflow für die Golden Gate-Montage demonstriert.
Nach der Transformation der Montagereaktion wurden erfolgreiche Baugruppen mit dem Standard-Blauweiß-Screening von E.coli-Kolonien identifiziert. Die eYFP-Expressionskassette im Vektor der Ebene 1 und der Endlink-Eins-Vektor wurden dann zu einem Akzeptorvektor der Ebene T zusammengesetzt, um dem Vektor cpcBA-eYFP zu geben. Der montierte cpcBA-eYFP-Vektor wurde durch Restriktionsverdauung verifiziert.
Die erfolgreiche eheliche Übertragung von cpcBA-eYFP oder dem pPMQAK1-T-Vektor führte zu einem Wachstum von bis zu mehreren hundert Kolonien auf der Membran für Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973. Wie für den starken Pcpc560-Promotor erwartet, waren die Werte für normalisierte eYFP-Fluoreszenz vom Plattenleser und die eYFP-Fluoreszenz pro Zelle aus dem Durchflusszytometer im Vergleich zur Negativkontrolle hoch. Sowohl beim Plattenleser als auch beim Durchflusszytometer waren die Fluoreszenzwerte in Synechococcus elongatus UTEX 2973 höher als bei Synechocystis PCC 6803.
Stellen Sie sicher, dass Sie für die minimale Zeit inkubieren, je nachdem, welche Sorte Sie konjugieren.
