세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

이 방법은 플라스미드 DNA가 다른 박테리아 사이에서 얼마나 자주 퍼질 수 있는지에 관하여 미생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배경을 줄임으로써 고해상도로 컨쥬게이션 주파수의 작은 차이를 감지할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생인 야나기야 코스케가 될 것입니다.

가장 가능한 수로 컨쥬게이션 주파수를 계산하려면, 필터는 하룻밤 기증자 문화에서 1 밀리리터를 30°C에서 45분 동안 1밀리리터로 메이트합니다. 공동 문화가 인큐베이팅하는 동안, 기증자 루리아 국물에 삼중 도금에 대한 원래 기증자와 받는 문화를 연속적으로 희석, 또는 카나마이신, 또는 받는 사람 LB 플러스 30 섭씨에서 이틀 문화에 대한 겐타마이신 플레이트. 인큐베이션의 끝에서, 4중 세포 배양판에서 직렬 희석을 위해 카나마이신과 젠타마이신을 함유한 멸균 LB의 필터에 배양을 재연한다.

섭씨 30도에서 이틀 후, 기증자 및 수령인 한천 플레이트및 경미세검사에 의해 트랜스컨쥬개가 증가하는 우물의 수에 식민지 형성 단위 또는 CfU를 수동으로 계산합니다. 가장 가능한 숫자와 편차를 계산하려면 MPN 계산 프로그램을 엽니다. 실험의 이름과 날짜, 테스트 시리즈의 수 및 스프레드시트 파일의 프로그램 시트 7개행에 최대 희석 수를 입력합니다.

자동으로 생성된 입력 데이터 테이블에서 희석 계수 D 열, 밀리리터 또는 GW 열의 볼륨에 0.01, 튜브 N 열 수에 4개의 수식을 입력합니다. 각 샘플 희석에서 트랜스컨쥬펀트가 증가한 우물수를 입력하고 계산 결과를 클릭하여 밀리리터당 가장 가능성이 높은 수와 95% 신뢰도가 상하로 높은 결과를 얻습니다. 그런 다음 플라스미드의 컨쥬게이션 주파수를 계산하기 위해 밀리리터당 기증자 및 수령인 콜로니 형성 단위의 수로 트랜스컨쥬트 수를 나눕니다.

본 대표적인 실험에서, pBP136:gfp 플라스미드에 도입된 배양에 대해 0과 400 RPM 사이에 관찰된 컨쥬레이션 주파수의 최대 차이로 두 플라스미드의 컨쥬션 빈도가 더 높은 교반률로 증가했으며, pCAR1:gfp pfpsmid에 도입된 배양에 대해 0~200RPM 사이에 나타났다. 결합 의 확률을 비교하는 데 필요한 받는 세포의 밀도를 결정하기 위해 짝짓기 해석은 다른 기증자 및 받는 사람 밀도로 수행되었습니다. 본 대표적인 실험에서 pBP136:gfp 트랜스컨쥬Gants는 기증자의 10~3차 CFU를 10~10~10회, 10~10회 10~10회 10~10회, 기증자의 제2 CFU10~10~10~10~10~10~100회 CFU를 검출하였다. , 세포 밀도가 너무 높았다는 것을 나타낸다.

기증자의 10 CFU와 짝짓기 분석 10 받는 사람의 다섯 번째 CFU에 10 또는 10, 그러나, 트랜스 콩주 간트 양성 우물의 감소 수의 결과. 따라서, 10~제5CFU의 수신자는 단일 기증자 세포와 짝짓기위해 요구될 것으로 예측되었다. 기증자와 받는 사람 균주의 다른 밀도에서 pCAR1:gfp와 결합 분석 유사한 결과 설명, 비록 전반적인 트랜스 콩주 간 긍정적인 우물의 비율은 pBP136:gfp의 그 보다 훨씬 낮았다.

기증자와 수령인 세포가 유사하게 서로 부착할 수 있다고 가정하면 pCAR1 기증자에 대한 유도 개시 확률은 pBP136 기증자의 경우보다 낮았습니다. 이러한 결과에 기초하여, 10받는 사람의 일곱 번째 CFU가 FACS에 의해 정렬 된 단일 기증자 세포에 필요한 것으로 추정되었다. 트랜스컨주간트 양성 우물의 수를 계산한 후, pBP136:gfp에 대한 트랜스콘주간트 양성 우물의 백분율은 pCAR1:gfp에 비해 더 큰 것으로 결정되었으며, 이 두 플라스미드 사이의 공조 개시 연상 확률에 36배 이상의 차이를 보여 주었습니다.

시술을 시도하는 동안, 항상 신중하게 세균 혼합물을 희석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.