مقارنة عالية الاستبانة للترددات الاقتران البكتيري

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة حول عدد المرات التي يمكن أن ينتشر فيها الحمض النووي البلازميد بين البكتيريا المختلفة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من خلال الحد من الخلفية ، يمكننا اكتشاف اختلافات صغيرة في تردد الاقتران بدقة عالية. إثبات الإجراء سيكون كوسوكي ياناغيا، وهو طالب دراسات عليا من مختبري.

لحساب تردد الاقتران حسب العدد الأكثر احتمالا، مرشح ميت ملليلتر واحد من ثقافة المانحين بين عشية وضحاها مع ملليلتر واحد من ثقافة المتلقي بين عشية وضحاها لمدة 45 دقيقة في 30 درجة مئوية، كما هو موضح للتو. في حين أن الثقافة المشتركة هي احتضان، وتمييع تسلسليا المانح الأصلي والثقافات المتلقي للطلاء في ثلاث ية على مرق لوريا المانحة، أو LB، بالإضافة إلى kanamycin، أو LB المتلقي بالإضافة إلى لوحات gentamycin لثقافة لمدة يومين في 30 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، resuspend الثقافة على مرشح في LB العقيمة التي تحتوي على كاناميسين وجنتاميسين لتخفيف المسلسل في لوحة ثقافة خلية 96 جيدا في رباعية.

بعد يومين في 30 درجة مئوية، عد يدويا وحدات تشكيل مستعمرة، أو CFUs، على لوحات أجار المانحة والمتلقية وعدد الآبار التي تنمو عبر conconjugants عن طريق المجهر الخفيفة. لحساب العدد الأكثر احتمالاً والانحراف، افتح برنامج حساب MPN. أدخل اسم وتاريخ التجربة، وعدد سلسلة الاختبار، والحد الأقصى لعدد عمليات التخفيف في الصف السابع من ورقة البرنامج لملف جدول البيانات.

في جداول بيانات الإدخال المنتجة تلقائياً، أدخل الصيغة في عمود عامل التخفيف D، 0.01 في وحدة التخزين بالميليلتر أو عمود GW، وأربعة في عدد أعمدة الأنابيب N. أدخل عدد الآبار التي نمت فيها عمليات التعقّب عبر الأخرى عند كل عينة من تخفيفها وانقر فوق نتائج حساب النتائج للحصول على النتائج كرقم محتمل أكثر لكل ملليلتر، وحدود الثقة العليا والدنيا بنسبة 95٪. ثم تقسيم عدد من transconjugants على عدد من المانحة والمتلقية تشكيل وحدات مستعمرة لكل ملليلتر لحساب تردد الاقتران من البلازميدات.

في هذه التجربة التمثيلية، زاد تردد الاقتران لكلا البلازميدات بمعدلات إثارة أعلى مع فارق أقصى في تردد الالاقتران لوحظ بين صفر و400 دورة في الدقيقة للثقافات التي تم إدخالها إلى pBP136:gfp plasmid، وبين صفر و200 دورة في الدقيقة للثقافات التي تم إدخالها إلى pCAR1:gfp plasmid. ولتحديد كثافة الخلايا المتلقية المطلوبة لمقارنة احتمالية الاقتران، أجريت مقايسات التزاوج مع كثافات مختلفة من المتبرعين والمتلقيين. في هذه التجربة التمثيلية، تم الكشف عن pBP136: gfp transconjugants في 100٪ من الآبار التي تحتوي على مرة واحدة 10 إلى CFU الثالثة من المانحة ومرات واحدة 10 إلى 10 إلى CFU السابعة من المتلقي، وتلك مع واحد مرات 10 إلى CFU الثانية من المانحة ومرات واحدة 10 إلى السادس إلى 10 إلى CFU السابع المتلقي من ، مما يشير إلى أن كثافة الخلية كانت عالية جداً.

غير أن التزاوج مع 10 من المتبرعين و10 إلى سادس أو 10 إلى الوحدة الخامسة من المتلقي، أدى إلى انخفاض عدد الآبار الإيجابية عبر المخالفة. وهكذا، كان من المتوقع أن تكون 10 إلى الوحدة الخامسة من المتلقين لازمة للتزاوج مع خلية مانحة واحدة. وأظهرت مقايسات التزاوج مع pCAR1:gfp في كثافات مختلفة من سلالات المانحين والمتلقيين نتائج مماثلة ، على الرغم من أن النسب المئوية للآبار الإيجابية عبر الاقتضاء كانت بشكل عام أقل بكثير من تلك الموجودة في pBP136:gfp.

وبافتراض أن خلايا المانح والمتلقي يمكن أن تُرِق ببعضها البعض، فإن احتمال بدء إجراء اقتران للمتبرع بـ pCAR1 كان أقل من احتمال المتبرع pBP136. واستنادا إلى هذه النتائج، قدر أن 10 إلى المبلغ السابع من المتلقي كان مطلوبا من خلية مانحة واحدة مصنفة حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد عد أعداد الآبار الموجبة عبر تخوم، تم تحديد النسبة المئوية للآبار الموجبة عبر conconjugant لpBP136: GFP لتكون أكبر من تلك التي لpCAR1:GFP، مما يدل على وجود أكثر من 36 ضعف الفرق في احتمال المانحة بدأت الاقتران بين هذين plasmids.

أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائمًا تخفيف الخلائط البكتيرية بعناية.