Wir danken die Teilnehmern in der Kinder-Onkologie-Gruppe AAML1531-Studie und der Nurses' Health Studie für ihre Beiträge in Form von Patientenproben. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1 CA49449 und RO1 CA149445), der Kinderuni Discovery Institute of Washington St. Louis Children Hospital (MC-II-2015-461) und Eli Seth Matthews Leukämie Stiftung finanziert.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier zeigen wir eine Reihe von Fehler korrigiert Sequenzierung Protokolle, die leicht umsetzbar sind, um Mutationen mit niedrigen VAFs bei verschiedenen Krankheiten zu studieren. Der wichtigste Faktor ist die Einarbeitung von UMIs mit jedem Molekül vor der Sequenzierung, da sie Fehlerkorrektur des rohen lautet ermöglichen. Die hier beschriebenen Methoden erlauben Forschern, maßgeschneiderte UMIs zu handelsüblichen gen Panels und selbst entworfenen Gen-spezifischen Oligos zu integrieren.
Standardprotokoll NGS schließt den Nachweis von Mutationen mit VAF unter 2 % aufgrund der Sequenzierung Fehlerquote, und dies schränkt die Anwendung der NGS in Studien, in denen der Nachweis von seltenen Varianten entscheidend ist. Unter Umgehung den Normalsatz der NGS-Fehler, ermöglicht ECS empfindliche Detektion dieser rohen Varianten. Nachweis von pathogenen Mutationen, wenn diese Mutationen erst entstehen (also mit niedrigen VAF) unbedingt zum Beispiel Frühförderung der Krankheit14,15zu informieren. In der Leukämie-Forschung, die Erkennung von minimal Residual Krankheit (residual leukämischen Zellen nach der Behandlung) informiert risikostratifizierung und Behandlungsmöglichkeiten in einer Art und Weise zu informieren, die binäre Fluss durchflusszytometrischen Bewertungen können nicht genutzt werden. Darüber hinaus gilt ECS zirkulierenden Tumor Nukleinsäure erkennen und bewerten metastasiertem Potenzial bei soliden Tumorpatienten durch die Bewertung für die Anwesenheit/Abwesenheit sowie die Variante Belastung durch bestimmte Mutationen, die Merkmale des primären Tumor-16.
Wie in Tabelle 1gezeigt hat, hängt die Macht der Verwendung Binomialverteilung-basierte Position-spezifischen Fehlermodell Varianten nennen die Anzahl der sequenzierten Bibliotheken sowie die Tiefe der Sequenzierung verwendet, um das Fehlermodell zu bauen. Die Robustheit des Modells Fehler steigt mit höheren Anzahl von Proben und Sequenzierung eingehender. Es wird empfohlen, mindestens 10 sequenzierte Proben mit einem Durchschnitt von Fehler-Korrektur lesen Sie Abdeckung von 3000 X pro Probe verwenden, um für jede Probe ein Fehler-Profil zu erstellen. Die Position-spezifischen Ansatz ist ähnlich wie MAGERI, sondern anstelle einer aggregierten Fehlerquote für alle sechs unterschiedliche Substitution (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, modellieren wir jede Ersetzung unabhängig voneinander in jeder Position. Zum Beispiel eine Fehlerrate von C > T an einer bestimmten genomische Position unterscheidet sich von einer anderen Position. Unser Ansatz berücksichtigt auch eine Sequencing Batch Wirkung, wie die Basis Substitution Rate beobachtet in einem Sequenzierung Lauf laufen unterschiedlich sein könnte. Daher ist es wichtig, jede Position für alle Arten der Substitution zu modellieren, vor allem, wenn Proben aus verschiedenen Sequenzierung läuft für die Modellerstellung zusammengefasst sind.
Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung ein ECS-Experiment ist der gewünschte Nachweisgrenze. Die Schönheit der NGS Studien ist, dass sie in Bezug auf die Gene/Ziele von Interesse, Nachweisgrenze (diktiert von der Tiefe der Sequenzierung) und Anzahl der Personen abgefragt leicht skaliert werden können. Zum Beispiel, wenn die Forscher interessiert, seltene Mutationen in zwei Amplifikate mit einer Nachweisgrenze von 0,0001 zu finden sind, können sie maximal 75 Proben in einem einzigen Sequenzierung mit MiSeq V2-Chemie, die bis zu 15 Millionen mal gelesen Ausgänge ausgeführt bündeln (2 Amplifikate * 10.000 Moleküle * 10 liest für Fehlerkorrektur * 75 Proben = 15 Millionen Sequenzierung liest). Forscher können die Anzahl der Moleküle ins Sequenzierung oder die Anzahl der gepoolten Proben in einer einzigen Sequenzierung ausgeführt, um die Nachweisgrenze anpassen variieren. In unseren Studien sollen wir Mutationen mit einer Nachweisgrenze von 0,0001 VAF (01:10, 000) mit dem Illumina-gen-Panel. Wir verwenden routinemäßig 250 ng DNA, um sicherzustellen, dass genügend Moleküle erfasst werden, zur Erreichung die oben genannten Nachweisgrenze zu starten. Forscher können um mit geringeren Menge an DNA zu beginnen (50 ng empfohlen) Wenn die gewünschte Nachweisgrenze liegt > 0,001 VAF.
Da die UMIs auf die i5-Indizes angehängt sind, verfügen über Sequenzierung Einstellungen entsprechend geändert werden. Zum Beispiel wir 16 N UMIs verwendet, und die Sequenzierung Einstellungen waren 2 x 144 gekoppelten Ende liest, 8 Zyklen der Index 1 und 16 Zyklen von Index 2 im Gegensatz zu den üblichen 8 Zyklen der Index 2. Der Index 2 Takt ist durch einen Rückgang der Gesamtzahl der Zyklen zugeteilt, der liest ausgeglichen. Wenn Forscher 12N UMIs10,17verwenden entscheiden, sollten die Einstellungen 12 Zyklen der Index 2 geändert werden.
Diese UMI-basierte Sequenzierung Methode ist optimiert, um für Sequenzierung Fehler zu korrigieren. Es bleibt suboptimale im Umgang mit PCR-Jackpotting, das ist ein Thema für alle Verstärkung basierende Methode. Wir Runden von Post-Sequenzierung und Post-Bioinformatik-Validierung mit DdPCR durchgeführt, und wir kaum erkennen Fehlalarme durch PCR Jackpotting. Dennoch empfiehlt es sich, dass Forscher die Experimente mit High Fidelity Polymerase um zu niedrige Verstärkung Fehler zu gewährleisten.

Wie wir Alter, Belastung durch Mutagene und stochastische Fehler während der Zellteilung führen zu die Ansammlung von somatischen Aberrationen in das Genom, und dies zugrunde liegt die grundlegende Pathogenese der malignen Transformation, Neuro-developmental Krankheiten, pädiatrische Störungen und normalem Altern1,2. Somatische Mutationen mit Krankheit fahren Potenzial sind wichtige diagnostische und prognostische Biomarker zur Früherkennung und Risiko Management3,4,5. Um physiologische Clonogenesis besser zu verstehen, ist die klinische informieren und Entscheidungen, die genaue Quantifizierung Charakterisierung dieser Mutationen und von vorrangiger Bedeutung. Next Generation Sequencing (NGS) wird derzeit zur klonale Mutationen in heterogenen DNA-Proben zu studieren; NGS ist jedoch begrenzt zur Identifizierung von Mutationen bei > 0,02 Variante Allel Bruchteil (VAF) – aufgrund der inhärenten Fehler-Rate von 0,5-2,0 % der Sequenzierung Plattformen6,7,8. Infolgedessen tracking diagnostisch und prognostisch bedeutende somatische Varianten am unteren VAF gelingt nicht mit standard NGS.
Vor kurzem wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Fehlerquote von NGS8,9,10,11zu umgehen. Diese Methoden nutzen Molekulare Kennzeichnung, wodurch Fehlerkorrektur nach Sequenzierung. Jedes Molekül oder genomische Fragment in der Sequenzierung Bibliothek ist mit einer zufälligen einzigartige molekulare Bezeichner (UMI) markiert, die spezifisch für dieses Molekül ist. Die UMIs sind von Permutationen einer Reihe von randomisierten Nukleotiden (8 – 16 N) gebaut. Ein zweite Probe-spezifischen Barcode ist auch in den Workflow integriert, die es ermöglicht, Multiplexen mehrerer Proben in der gleichen NGS-Sequenzierung ausgeführt. PCR-Amplifikation erfolgt auf der Molekular tagged Bibliothek, und anschließend wird die Bibliothek für die Sequenzierung gesendet. Während der Vorbereitung der Bibliothek wird erwartet, dass Fehler nach dem Zufallsprinzip auf die genomische Fragment während der PCR-Amplifikation und Sequenzierung8eingeführt werden. Um zufällige Abfolge Fehler zu entfernen, sind rohe Sequenzierung liest nach UMI gruppiert. Artefakte aus Sequenzierung sollen nicht in alle Lesevorgänge mit der gleichen UMI an derselben genomische Position durch die stochastische Natur der Einführung, vorhanden sein, während eine wahre Variante wird originalgetreu verstärkt und sequenziert in alle Lesevorgänge, die die gleichen UMI teilen. Die Artefakte sind Bioinformatically entfernt. Hier beschreiben wir drei Methoden der Fehler korrigiert Sequenzierung (ECS) optimiert, im Labor für DNA, Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) und kleinen einfügen-Löschungen (Indels) zu identifizieren, und RNA zur Quantifizierung der Genexpression unten erleichtern die NGS Fehlerschwellenwert.
Die erste Methode beschreibt eine Möglichkeit, somatische selten mit Gen spezifische Primer entwickelt von Forschern zu suchen. Vor der Bibliothek Vorbereitung sollten Forscher Primer an die Fragmente von Interesse gezielt gestalten. Wir haben die Web-app-Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplifikate von 200 – 250 bp sind ideal für Polymerase-Kettenreaktion (PCR), da diese werden sobald UMIs eingeflossen sind, erzeugen, überlappende gepaart Ende liest mit 150 bp gepaart Ende liest. Die optimale Grundierung Gestaltung Bedingungen verwendet werden: Grundierung Mindestgröße = 19; Optimale Grundierung Größe = 25; Maximale Grundierung Größe = 30; Minimale Tm = 64 ° C; Optimale Tm = 70 ° C; Maximale Tm = 74 ° C; Maximale Differenz Tm = 5 ° C; Minimale GC-Gehalt = 45; Maximale GC-Gehalt = 80; Anzahl zurück = 20; Maximal 3' Ende Stabilität = 100.
In Methode 2 beschreiben wir eine Methode kombiniert die ECS-DNA-Protokoll mit Illumina Chemie für klonale SNVs und so selten wie 0,0001 VAF mit handelsüblichen gen-Paneele, die Hunderte von Amplifikate enthalten kleine Indels vermessen. Wir haben die TruSight myeloische Sequenzierung Panel (Illumina) für unser Experiment verwendet und entwickelt eine erweiterte Gruppe um zusätzliche Gene von Interesse für pädiatrische myeloische Erkrankungen gehören. Diese Platten haben nicht eindeutige molekularen Kennungen (UMIs) angeboten, die Fehlerkorrektur, erleichtern würde, so dass wir unsere eigene Adapter Strategie diese Platten hinzugefügt haben. ECS sollte funktionieren ebenso gut mit allen anderen Panels entwickelt, um nach Genen verbunden mit verschiedenen Krankheiten zu bereichern. Nach DNA-Isolierung und anschließende Quantifizierung von Gewebe oder Probe von Interesse, es wird empfohlen, mindestens 500 ng des Bestandes DNA pro Probe. Wir machen regelmäßig eine einzelne Sequenzierung Bibliothek mit 250 ng DNA um flussabwärts als viel einzigartige genomische Fragment wie möglich erfassen liest Deduplizierung und VAF-Berechnung. Eine optionale replizieren Sequenzierung Bibliothek vorgenommen werden, mit dem restlichen 250 ng DNA. Wir machen immer zwei replizieren Bibliotheken pro Probe, und wir betrachten nur die Ereignisse, die unabhängig voneinander in beide Replikate als richtig positive Ergebnisse festgestellt. Wir implementierten auch eine genomische Position-spezifischen binomische Fehlermodell zur Erhöhung der Genauigkeit der Variante4,13aufrufen.
Schließlich beschreiben wir eine Methode, die Kopplung von ECS an RNA Sequenzierung für Transkript Quantifizierung mit handelsüblichen QIAseq gezielt RNA-Paneele (Qiagen). Die UMIs erforderlich für Deduplizierung können und Fehlerkorrektur in den Kits aufgenommen wurden, und Forscher Bibliotheken nach Empfehlungen des Herstellers. Bioinformatically, können Forscher folgen die Pipeline für ECS-DNA, die im Detail im Abschnitt Protokoll erklärt werden skizziert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI i5 adapter sequences</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7442S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7595S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-130-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie 2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

Techniken der konventionellen Next Generation Sequencing (NGS) haben immense genomische Charakterisierung für mehr als zehn Jahren ermöglicht. Insbesondere wurde NGS verwendet, das Spektrum der klonalen Mutationen in Bösartigkeit zu analysieren. Obwohl wesentlich effizienter als herkömmliche Sanger, NGS Kämpfe mit der Identifizierung von seltenen klonaler und subclonal Mutationen aufgrund seiner hohen Fehlerquote von ~0.5–2.0 %. So standard NGS hat ein Limit von Erkennung für Mutationen, die > 0,02 Variante Allel Bruchteil (VAF). Während die klinische Signifikanz für Mutationen dieser selten bei Patienten ohne bekannte Krankheit unklar für Leukämie behandelte Patienten haben sich deutlich verbessert Ergebnisse wenn Resterkrankung ist < 0,0001 durch Durchflusszytometrie. Um diese artifizielle Hintergrund der NGS zu mildern, wurden zahlreiche Methoden entwickelt. Hier beschreiben wir eine Methode für Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung (ECS), die Kennzeichnung einzelner Moleküle mit einem 16 bp zufällige Index für Fehlerkorrektur und 8 bp patientenspezifische Index für multiplexing beinhaltet. Unsere Methode erkennt und klonale Mutationen bei Variante Allel Brüche (VAFs) zwei Größenordnungen niedriger als die Nachweisgrenze von NGS und so selten wie 0,0001 VAF zu verfolgen.

Mit Targeted Error-Corrected für die DNA-Sequenzierung haben wir einen Nachweis der Prinzip Experiment verdünnen mutierten Patienten DNA in kommerziellen genomischer DNA durchgeführt. Der Patient hatte eine Mutation im GATA1 (ChrX:48650264, C > G) mit original VAF von 0,19. In Abbildung 1 zeigen wir, dass ECS quantitative auf ein Niveau von 1: 10.000 für Einzel-Nukleotid-Variante ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Abbildung 1: Verdünnungsreihen GATA1 SNV nachzuweisen, dass ECS quantitative auf das Niveau von 1: 10.000 ist. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wir zeigen auch, dass die ECS-DNA zuverlässig seltene klonale Mutationen in Genen wiederkehrend in Erwachsenen akute myeloische Leukämie (AML) bei gesunden älteren Personen4 erkennt. Wir erhalten buffy Coat Proben von 20 gesunde Individuen in der Nurse Health Study überhöht etwa ~ 10 Jahre auseinander. An diesen Proben haben wir das ECS-DNA-Panel-Protokoll angewendet. Für dieses Experiment wir die Illumina TruSight myeloische Sequenzierung Panel, das besteht aus 568 Amplifikate (Weitere Informationen auf Gen-Liste auf https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) angepasst und sequenziert 80 Bibliotheken ab 20 Personen (2 Sammlungen zu verschiedenen Zeitpunkten, 2 Wiederholungen pro Person pro Zeit Punkt) mit Illumina NextSeq Plattform, die einen Durchschnitt von 47,7 Millionen gepaart Ende liest und einen Durchschnitt von 3,4 Millionen Fehler korrigiert generiert Konsensus-Sequenzen pro Bibliothek4. Die mittlere Nukleotid-Abdeckung pro Bibliothek war etwa 6.000 x (3,4 Millionen geteilt durch 568). Für jede Probe errichteten wir ein Position-spezifische Fehler Profil sequenzierte Bibliotheken, die nicht aus derselben Probe verwenden. Wir fanden 109 klonale somatische Mutationen, die in beiden Wiederholungen mindestens eine Sammelstelle Zeit vorhanden waren. Diese Mutationen haben VAF von 0,0003 – 0.1451. Wir wählten 21 Mutationen mit bekannten kosmischen Darstellungen und überprüft alle 21 Mutationen in ein oder zwei Sammlung Zeit Punkt(e) mit DdPCR (n = 34, Abbildung 2, adaptiert von jungen Et Al. 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Abbildung 2: Mutationen von ECS identifiziert wurden über DdPCR mit höchst konkordante VAFs verifiziert. (n = 34, modifiziert von jung Et Al. 20164). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In Bezug auf Fehler korrigiert Ausdruck mit ECS-RNA-Protokoll wir ein Gen Panel mit QIAseq-Chemie, die besteht aus 416 Gene bekannt, verbunden mit verschiedenen Krebsarten (adaptiert von QIAseq menschlichen Krebs Transkriptom-Panel), und wir werden angepasst die am häufigsten geäußerten Exon eines bestimmten Gens (Gen Liste in ergänzenden Material 1) verstärkt. Wir sequenziert die Bibliotheken mit Illumina MiSeq Plattform in gepaart-End-Format, die durchschnittlich 8,3 Millionen Lesevorgänge pro Bibliothek gegeben hat, und uns gelungen, einen Durchschnitt von 0,417 Millionen Fehler korrigiert Konsensus-Sequenzen einzufangen. Wir zeigten, dass die Expression von niedrigen Fülle Transkript (< 1.000 Transkript Graf in 50 ng von Gesamt-RNS) ist sehr reproduzierbar auf Wiederholungen (Datenpunkt n = 300, Abbildung 3). Validierung von DdPCR (sechs ausgewählter Gene von unterschiedlichem Ausmaß des Ausdrucks) gezeigt, dass die Expression von Genen durch das ECS-Protokoll ohne die Notwendigkeit einer Normalisierung korrekt eingenommen worden war.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Abbildung 3: Top, Korrelation der Mitschrift zählt von ECS-RNA auf Wiederholungen der gleichen Probe (n = 300). Unten, Abschrift, die Grafen von ECS identifiziert wurden durch DdPCR überprüft (n = 6). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Serie: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...