Zebrafisch entwickelt sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodell für die Untersuchung der Chromosomenereignisse der Meiose einschließlich homologer Chromosomenpaarung, Synapsis und Rekombination. Dieses Protokoll zur Verbreitung nuklearer Oberflächen hat es uns ermöglicht, die wichtigsten Merkmale der meiotischen Chromosomenarchitektur mithilfe der Superauflösungsmikroskopie zu visualisieren. Forscher können Hunderte von gut verteilten Kernen pro Rutsche mit weniger Schutt als andere Zebrafisch-Verbreitungprotokolle erwarten.
Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Verfahrens ist die Zerlegung der Zebrafischhoden, da sie sich in unmittelbarer Nähe zur Haut befinden und auch an anderen Organen befestigt sind. Die Visualisierung des Sezierverfahrens ermöglicht es den Forschern zu wissen, was sie erwartet, wenn sie die Imobaden im Gewebe des Tieres eingebettet sehen. Nach der Einschläferne männlicher Zebrafische enthaupten Sie einen Fisch nach dem anderen mit einer kleinen Schere und verwenden Sie dann eine Mikroschere, um entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, um die Körperhöhle freizulegen.
Legen Sie den Fisch in eine silikonbeschichtete Petrischale und decken Sie ihn mit einem flachen Pool von 1X PBS ab. Unter einem Mikroskop bei 1,65-facher Vergrößerung sezieren Sie die Hoden mit Zangen. Entfernen Sie so viel wie Fett und umgebendes Gewebe aus den Hoden wie möglich.
Die Gonade erscheint lichtdurchlässig unter dem Sezierbereich, während das umgebende Fett ein etwas dunkleres Aussehen haben kann. Einige Menge an Fett kann auf der Gonade gelassen werden, ohne das Verfahren zu behindern. Fügen Sie jeden sezierten Hoden direkt in eine Fünf-Milliliter-Röhre mit zwei Milliliter DMEM und halten Sie auf Eis.
Um die Hodenzellen zu dissoziieren, fügen Sie 200 Mikroliter Kollagenaselösung mit den Hoden in die Fünf-Milliliter-Röhre ein. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals invertieren. Schütteln Sie die Hoden in einem Inkubator-Shaker bei 100 Umdrehungen bei 32 Grad Celsius vorsichtig.
Schnell es alle 10 Minuten invertieren, um die Dissoziation zu erleichtern. Nach einer Stunde ist das DMEM trüb und die Hoden sind in kleinen Brocken. Während die Hoden in Kollagennase inkubiert werden, vorwärmen 100 Mikroliter 0,1 Molar Saccharose Lösung auf 37 Grad Celsius.
Um die Kollagenase auszuwaschen, fügen Sie DMEM zu einem Endvolumen von fünf Millilitern hinzu und invertieren Sie das Rohr ein paar Mal. Pellet die Hoden bei 200 g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie drei Milliliter des Überstandes, so dass nur noch zwei Milliliter übrig bleiben.
Wiederholen Sie die DMEM-Wäsche zwei weitere Male. Nach der letzten DMEM-Wäsche vier Milliliter des Überstandes entfernen und einen Milliliter DMEM, 200 Mikroliter Trypsinlösung und 20 Mikroliter DNase I-Lösung hinzufügen. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um die Lösung zu mischen.
Schütteln Sie das Rohr bei 32 Grad Celsius bei 100 U/min horizontal. Schnell es alle fünf Minuten invertieren, um die Dissoziation zu erleichtern. Nach fünf bis 15 Minuten enthält die DMEM-Lösung nur wenige Klumpen.
Fügen Sie 500 Mikroliter der Trypsin-Inhibitor-Lösung und 50 Mikroliter DNase I-Lösung hinzu. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal zu mischen, dann kurz drehen Sie sich bei 200 g für drei Minuten bei Raumtemperatur, um Flüssigkeit oder Klumpen zu entfernen, die an der Rohrkappe oder der Seite des Rohres haften können. Legen Sie das Rohr auf Eis und setzen Sie die Zellsuspension wieder auf, indem Sie wiederholt mit einer Kunststoff-Transferpipette für zwei Minuten nach oben und unten pfeifen, um die Dissoziation aller verbleibenden Klumpen zu erleichtern.
Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension nicht in die Glühbirne der Transferpipette gelangt. Dann ein 100-Mikron-Zellsieb mit DMEM vorbefeuchten und auf eine 50-Milliliter-Röhre auf Eis legen. Übertragen Sie die Zellsuspension durch das Sieb einen Tropfen nach dem anderen mit einer Kunststoff-Transferpipette.
Übertragen Sie das Filtrat mit einer Kunststoff-Transferpipette in ein neues Fünf-Milliliter-Rohr. Achten Sie darauf, die gepoolten Zellen zu sammeln, die an der Unterseite des Filters befestigt sind. DMEM in die Röhre zu einem Endvolumen von fünf Millilitern geben.
Pellet die Zellen bei 200 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören und fügen Sie fünf Mikroliter DNase I Lösung direkt in das Pellet. Mischen Sie dann das Pellet mit der DNase I Lösung, indem Sie den äußeren Boden des Rohres vier- bis fünfmal entlang eines leeren Mikrozentrifugenrohrträgers vorsichtig kratzen.
Fügen Sie DMEM zu einem Endvolumen von fünf Millilitern hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Pellet die Zellsuspension bei 200 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die DNase-Behandlung ein bis drei Mal zusätzlich, bis das resuspendierte Pellet nach Zugabe von DMEM nicht verklumpt.
Entfernen Sie nach der letzten Drehung so viel wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 1X PBS hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie den äußeren Boden des Rohres entlang eines leeren Rohrgestells vorsichtig kratzen. Pellet die Zellsuspension bei 200 g für fünf Minuten und dann entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.
Schneiden Sie drei Millimeter vom Ende einer 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die Blende zu verbreitern. Mit der geschnittenen Pipettenspitze das Pellet in 80 Mikrolitern 0,1 Molar-Saccharoselösung durch Pipettieren nach oben und unten wieder aufhängen. Lassen Sie die Zellaufhängung drei Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
Als nächstes, mit einer Pipette Spitze, beschichten Sie einen Schlitten mit 100 Mikroliter 1%Formaldehyd mit 0.15%Triton X-100. Dann fügen Sie 18 Mikroliter der Saccharosezellsuspension auf die Mitte der Rutsche in einer geraden Linie senkrecht zur langen Kante. Neigen Sie die Folie hin und her, um die Ausbreitung der Zellsuspension auf alle Ecken zu erleichtern.
Legen Sie die Dias flach in eine leicht rissige offene Feuchtigkeitskammer, um das Trocknen der Formaldehydlösung zu verhindern. Legen Sie die Feuchtigkeitskammer über Nacht in eine dunkle Schublade. Am Morgen den Deckel aus der Feuchtigkeitskammer entfernen und die Rutschen vollständig trocknen lassen.
Legen Sie die Dias in ein Coplin-Glas und füllen Sie dann das Coplin-Glas mit destilliertem Wasser. Fünf Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Gießen Sie das Wasser aus und füllen Sie das Glas mit einem bis 250 Benetzungsmittel.
Zwei Mal für jeweils fünf Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur waschen. Lassen Sie die Rutschen vollständig trocknen und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie gebeizt sind. Dieses Protokoll skizzierte eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung der Spermatozytenausbreitung von Zebrafischen, die gut verteilte, nicht überlappende Kerne hervorbringt.
Die Panels auf der linken Seite zeigen drei Stufen von meiotischer Prophase, Leptotene, frühes Zygoten und Pachytene. Telomere waren für jede Stufe magentagefärbt. Ein Beispiel für schlechte Qualität Spreads aufgrund unzureichender DNase I Behandlungen werden hier gezeigt.
Meiotische Chromosomen, die für SYCP3 gebeizt werden, deuten auf überlappende Kerne aufgrund einer viskosen Saccharosezellsuspension hin, die verhindert, dass sich Zellen auf dem Dia richtig ausbreiten. Es ist sehr wichtig, mit der richtigen Menge an Ausgangsmaterial zu beginnen, Zebrafischhoden für die entsprechende Zeit in Trypsin zu behandeln und die notwendige Anzahl von DNase-I-Behandlungen durchzuführen, da dies nicht zu sehr wenigen Kernen oder verklumpten Kernen führen kann. Bei der Arbeit mit Formaldehyd sollte immer die richtige PSA getragen werden.
Im Anschluss an das Verbreitungsverfahren können Chromosomen gefärbt werden, um verschiedene Chromosomenstrukturen sowie Doppelstrangbrüche zu visualisieren, um die zeitliche Abhängigkeit und Lokalisierung meiotischer Ereignisse zu analysieren. Unsere Technik hat den Weg geebnet, um zu zeigen, dass Zebrafische ein besseres Modell der menschlichen Spermatogenese sein können als Maus basierend auf den Chromosomenmerkmalen und dem Telomerstrauß.
