Name: preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography at JoVE.com

This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

Achtung: Konsultieren Sie die Sicherheitsdatenblätter (MSDS) der verschiedenen Reagenzien vor der Verwendung. Einige der Chemikalien bei der Probenvorbereitung verwendet werden, sind giftig, krebserregend, erbgutverändernd und / oder fortpflanzungsgefährdende. Persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe) und arbeiten unter einem Abzug, während die Probe Handhabung. Sectioning der Probe mit einem Ultramikrotom beinhaltet die Verwendung von scharfen Instrumenten, und sorgfältige Verwendung dieser Werkzeuge ist obligatorisch. In den Schritten unten beschrieben, nehmen die Autoren, dass die Probe eine Zellkulturprobe ist. Das Protokoll müssen nach dem Probentyp geändert werden, vor allem die Zentrifugationsschritte. 1. Herstellung von Puffern und Mischungen <ol><li> Bereiten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 und 1,76 mM KH 2 PO 4). </li><li> Herstellung von Lösungen, die 30%, 50% und 70% etHANOL in PBS für die Dehydratisierung Probe. Führen Austrocknung Probe durch die schrittweise Inkubation der Probe Ethanolkonzentrationen zu erhöhen. </li><li> Bereiten Epoxyharz durch Mischen von Bisphenol-A- (Epichlorhydrin) (20 ml), Dodecenylbernsteinsäureanhydrid (9 ml), Methyl-5-norbornen-2,3-dicarbonsäure (11 ml) und 2,4,6-tris ( dimethylaminomethyl) phenol (0,7 ml); andere Mischungsverhältnisse können in Abhängigkeit von der gewünschten Härte des Harzes verwendet werden. </li><li> Herstellung von Lösungen, die 30%, 50% und 70% Epoxyharz in Ethanol zur Probeneinbettung. Führen Harzeinbettung durch schrittweise Inkubation der Probe mit Harzkonzentrationen erhöhen. HINWEIS: Die Volumina der hergestellten Lösungen sind abhängig von der Art der Probe, die untersucht wird. Weitere Lösungen sind für Gewebe benötigt als für Zellkulturen. </li></ol> 2. Fixierung und Färbung der Probe <ol><li> Zentrifugieren der Zellkultur für 5 min bei 5000 x g. Führen alle folgenden Zentrifugationen die gleichen Bedingungen.</li><li> Überstand verwerfen und befestigen Sie das Zellpellet durch sie in PBS resuspendiert (1 ml) mit 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min (1A). Alternativ dazu fixieren die Zellen bei 4 ° C über Nacht am Wochenende oder über. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt und waschen Sie das Pellet 3 mal mit PBS (1 ml), um die Fixierungsmittel vollständig zu entfernen. </li><li> Post-fix die Probe mit 1% OsO 4 in PBS (1 ml) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt und waschen Sie das Pellet 3 mal mit PBS (1 ml) wurde die OsO 4 vollständig zu entfernen. Deaktivieren Sie die OsO 4 in Öl und entsorgen. </li><li> Fügen Sie 2% Uranylacetat in PBS (1 ml) als Kontrastmittel und Inkubieren der Probe für 30 min bei Raumtemperatur (1B). </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt und waschen Sie das Pellet 3 mal mit PBS (1 ml) des ungebundenen uranyl ac zu entfernenetate; Uranylacetat enthält radioaktive Elemente und sollte in einem Behälter für radioaktive Abfälle gewidmet entsorgt werden. HINWEIS: Die Inkubationszeiten können entsprechend der Größe der Probe verändert werden. Beispielsweise Fixierung und Färbung von dickeren Proben, wie Gewebeproben, erfordern längere Inkubationszeiten. Längere Inkubationszeiten können auch für die Dehydratation und den Einbettungsschritte besser sein. Uranylacetat kann durch eine &quot;uranyl lose&quot; Lösung ersetzt werden, die Gadolinium Salze enthält. </li></ol> 3. Probe Dehydration <ol><li> Die Probe 30 min bei 4 ° C in PBS (1 ml) mit 30% Ethanol (1C) nach dem Zentrifugieren der Überstand verworfen und inkubieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.1 Lösungen mit allmählich zunehmenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70% und bis zu 100%) verwendet wird. Während dieser Entwässerungsschritten beizubehalten die Probe bei 4 ° C für Konservierungszwecke Probe. </li><li> Nach der Zentrifugation verwerfen die SupernatAmeise und das Pellet in reinem Ethanol (1 ml) suspendieren; über Nacht bei 4 ° C inkubiert. </li></ol> 4. Harz Embedding <ol><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand verworfen und das Pellet in Ethanol mit 30% Epoxidharz (1 ml) für 30 min bei RT (Figur 1D). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.1 Lösungen mit allmählich zunehmender Epoxidharz-Konzentrationen (50%, 70% und bis zu 100%) verwendet wird. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Pellet in reinem Epoxidharz (1 ml); über Nacht bei RT inkubiert. Die Anwesenheit von Härte DMP-30 könnte die Polymerisation des Harzes auszulösen; Wenn dies geschieht, bereiten zwei Chargen von Epoxidharz, eines mit und eines ohne DMP-30. </li><li> Nach der Zentrifugation das Pellet in 200 &amp; mgr; l reinem Epoxidharz in einer Kunststoffkapsel (den Härter enthält); die Probe sollte auf der Unterseite der Kunststoffkapsel sein. </li></ol> 5. Harzpolymerisation <ol><li> ichncubate die Kunststoffkapsel, die Probe in einem Inkubator eingestellt bei 60 ° C für 48 h enthält; andere Arten von Harz kann mit verschiedenen Einstellungen polymerisieren. </li><li> Entfernen Sie die Kapsel aus dem Inkubator und stellen Sie sicher, dass das Harz polymerisiert werden; das Harz sollte hart sein, wenn gegen eine harte Oberfläche gedrückt wird. </li><li> Hinzufügen reinen Epoxidharz (mit der Härter) auf der Oberseite des polymerisierten Harzes mit der Probe; diese zusätzliche Schicht aus Harz wird es leichter, die Probe zu schneiden. Inkubieren der Kapsel bei 60 ° C für 48 h. </li></ol> 6. Proben Sectioning <ol><li> Montieren Sie die Probe Kopf nach unten in einen Probenhalter, so dass die Probe nach oben und fixieren sie auf dem Trimmblock des Ultramikrotom. Dicht verriegeln Sie den Hebel, um den Trimmblock mit dem Ultramikrotom zu sichern. </li><li> Mit einer Rasierklinge oder einem ähnlichen scharfen Schneidinstrument, schneiden Sie die Kunststoffkapsel heraus, dass es aus dem polymerisierten Harz zu trennen. Schneiden Sie das Harz, so dass die Probe enthalten ist,ed in Harz in etwa die Form einer Pyramide. Es besteht keine Notwendigkeit, die gesamte Kunststoffkapsel zu entfernen; nur entfernen Sie den Teil des polymerisierten Probe abdeckt. </li><li> Nehmen Sie die Kapsel und den Probenhalter aus der Trimmblock und installieren sie auf dem beweglichen Arm des Ultramikrotom. </li><li> Installieren Sie ein Schneidmesser auf dem Messerblock und schneiden genau die Gesichter der Pyramide. Die Verwendung von Fernglas wird empfohlen, eine perfekte Form der Pyramide zu geben; desto besser ist die Pyramide, desto besser sind die Abschnitte werden. </li><li> Nehmen Sie die Beschneidmesser und ersetzen sie durch eine Histologie Messer ab, die verwendet werden können, Abschnitte zu schneiden, die dicker als 0,5 um. </li><li> die Küvette der Histologie Messer mit der richtigen Menge an Wasser, bringen die Schneide des Messers auf der Oberfläche der Probe und verwenden Sie das Fernglas Nach dem Befüllen der Kapsel Steigungswinkel einzustellen, so dass das Messer in die Pyramide in Scheiben schneiden senkrecht wird. </li><li> Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit entsprechend der gewünschtenSchnittdicke zu erholen homogene Abschnitte. </li><li> Lassen Sie den Abschnitt Schwimmer über das Wasser und fischen sie mit einer Schleife. </li><li> Bewegen, um die Schleife zu einer Elektronenmikroskopie Kupfergitter, das oben auf Filterpapier gelegt ist. HINWEIS: Das Raster behandelt wurden, sollte vorher seine Hydrophilie zu erhöhen. Dies kann mit einem gitter Beschichtung Stift durchgeführt werden. </li><li> Durch die Wasseraufnahme durch das Filterpapier, lassen Sie den Abschnitt an das Netz bleiben. Lassen Sie es trocken für ein paar Minuten, bevor es in das Elektronenmikroskop eingeführt wird. </li></ol> 7. Entwurf des Durchbrenn Tilt-Serie <ol><li> Sammeln Sie durch fokalen Bilder bei konstanten Fokus-Intervallen. HINWEIS: Die Durchbrenn tilt-Serie bestehen aus einem Satz von Durchgangsbrenn Bildern, die bei jedem Neigungswinkel der Neigungs Reihe gesammelt werden. Die ganze Konzentration Amplitude sollte ausreichen, um die gesamte Probendicke zu decken. </li><li> Bestimmen Sie den Wert des Fokusintervalls. Wenn das Intervall gleich dem depth-Bereich, die gesamte Probe im Fokus sammeln; Diese Einstellung stellt den höchsten Sampling möglich. Wenn das Intervall größer ist als die Tiefe des Feldes ist, werden einige Teile der Probe nicht im Fokus erhalten werden, was bedeutet, dass einige Teile der Probe nicht in Fokus gesammelt werden. </li><li> Berechne die Tiefe-Feld eines Elektronenstrahls von der Wellenlänge des Elektrons und der Konvergenzhalbwinkel des Elektronenstrahls. Während die Wellenlänge der Elektronen direkt mit der Beschleunigungsspannung verknüpft ist, verwenden , um die Konvergenzhalbwinkel durch das Elektronenmikroskop Hersteller oder experimentell aus dem Beugungsmuster 16 einer bekannten Probe bestimmen. Da Elektronen bei einer Wellenlänge λ treffen die Probe mit einem Konvergenzhalbwinkel von α in einem Elektronenmikroskop beschleunigt, verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Schärfentiefe-Bereich (DOF) zu bestimmen: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> Entwurfdie Brenn Serie , so dass der ganze Fokus Amplitude der Probe bei ihrer maximalen scheinbaren Dicke (dh am höchsten Neigung) abdecken. HINWEIS: Eine 0,75 um dicke Probe bei einer 70 ° Neigung eine scheinbare Dicke von 2,19 &amp; mgr; m haben, so sollte der Fokus Amplitude größer als 2,19 &amp; mgr; m. Für dieses Beispiel, wenn der Fokus Intervall oben bestimmt ist gleich 50 nm, wird es 44 Bilder (2,19 &amp; mgr; m / 50 nm) erfordern die Probe bei seiner maximalen scheinbaren Dicke zu bedecken. Die ganze Fokusamplitude durch die Anzahl der Brennschritte multipliziert mit dem Wert des Fokusintervall gleich. Bei der höchsten Neigung (θ), wird die Probe scheinbare Dicke wie die folgenden definiert: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. Beispiel Imaging HINWEIS: Es geht über den Rahmen dieses Protokolls zu beschreiben, wie ein Elektronenmikroskop in STEM-Modus einzurichten; die meisten dieser Informationen kann ich findenn das Referenzhandbuch mit Hilfe des Elektronenmikroskops Hersteller zur Verfügung gestellt. Allerdings ist folgendes zu beachten: i) die Punktgröße entsprechend gewählt werden sollte auf die gewünschte Vergrößerung; ii) die Ronchigram müssen gut ausgerichtet ist; und iii) in BF-Modus muss die Kameralänge eingestellt werden ungestreute Elektronen zu wählen, während eine gute Beleuchtung des Detektors aufrechterhalten wird. Resin Abschnitte auf Elektronenmikroskopie Kupfergitter aufgebracht sollten vor der Bildaufnahme beleuchtet werden Schrumpfen zu verhindern. Harzschrumpfung und Aufladungseffekte könnten bei der Bildaufnahme verwechselt werden. Die Verwendung einer Objektivlinse Öffnung könnte die Probenstabilität zu verbessern, wenn Aufladungseffekte auftreten. Jedoch in dem speziellen Fall der STEM-Setups, die Objektivöffnung ist nicht kompatibel mit HAADF Bildgebungsmodus, und sehr kleine Öffnungen Ziel nicht mit BF Bildgebungsmodus kompatibel. <ol><li> Mit geringer Vergrößerung (etwa 20.000-in STEM), blättern Sie durch die Probe und suchen Sie die Region von Interesse. </li><li> Passen ter euzentrischen Höhe (Z-Achse), so dass der Bereich von Interesse nicht abtreibt, während die Probe dreht. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Objekt von Interesse in der gesamten Neigungsbereich sichtbar bleiben. </li><li> Wegen der erheblichen Anzahl von Bildern während eines Durchbrenn Tilt-Serie erworben haben, verwenden eine automatische Erfassungssoftware. Verwenden Sie entweder eine kommerzielle Lösung oder eine Software individuelle Datenerfassung entwerfen, falls gewünscht. Stellen Sie sicher, dass das Software-Programm in der Lage ist, die drei folgenden Schritte durchzuführen: <ol><li> Verfolgen und konzentrieren sich wie in einem Standard-Tilt-Serie Sammelsystem. </li><li> Sicherzustellen, dass die Durchbrenn Bilder mit der Z-Position der Probe überlappen. </li><li> eine Reihe von Durchbrenn Bilder bei jedem Neigungswinkel automatisch erwerben. </li></ol></li><li> Geben das Software - Programm die wichtigsten Parameter des Durchbrenn tilt-Serie (dh Brenn Intervallen Brennschritt minimalen Neigungswinkel, maximale Neigungswinkel, Neigungsschritt und Abtastgeschwindigkeit). </li><li> Anfangdie Bildsammlung Prozess und warten, bis das Software-Programm zu beenden. </li></ol> 9. Bildverarbeitung HINWEIS: In diesem Protokoll, das durch Brenn Tilt-Serie Verarbeitung wird mit ImageJ ausgeführt Plugins 17. Ergänzende Daten 1 zeigt ein ImageJ Makro für den Ausrichtungsschritt (TURBOREG) und In-Fokus-Informationen (Extended Depth of Field) für einen Durchbrenn Tilt-Serie entwickelt, um mit drei Fokuswerte für die Zusammenführung. <ol><li> Ausrichten der Bilder auf dem gleichen Neigungswinkel gesammelt (dh die Durchbrenn images). Da Bilder nicht das gleiche im Fokus befindlichen Informationen haben, nicht auf sie doch nicht die gleichen Funktionen für die Ausrichtung; führen Ausrichtung von benachbarten Bildern zwei durch zwei Ausrichtung (dh eine pyramidale Hierarchie folgend, mit den engsten Fokuswerte zuerst) mit TURBOREG 18, ein ImageJ Plugin. </li><li> überprüfen konsequent die Ausrichtung der Durchbrenn Bilder bei jedem Neigungswinkel.Stapeln Sie die ausgerichteten Durchbrenn Bilder Sichtkontrolle zu verbessern. ANMERKUNG: Nur die Zone, die im Fokus sollte bewegen, während durch den Stapel blättern. Eine genaue Ausrichtung ist die wichtigste Sache, da der folgende Schritt der Wiederherstellung der Informationen besteht, die im Fokus von verschiedenen Bildern. </li><li> Zusammenführen der Informationen , die im Fokus über Extended Depth of Field 19, ein ImageJ Plugin ist; Dies wird schließlich ein einzelnes Bild aus dem Stapel von Bildern erzeugen. Mehrere Einstellungen können während der depth-of-field Erholung, aber verwenden die höchsten Einstellungen, um die Bildinformation zu erhalten verwendet werden. HINWEIS: Der Neigungs-Serie jetzt aus einem einzigen Bild pro Neigungswinkel zusammengesetzt ist, wobei jedes Bild in der Fokusinformation enthält, aus dem Durchgangsbrenn Bilder gewonnen. </li><li> Verarbeiten Sie die Daten. HINWEIS: Standard-Tools für die Ausrichtung und Rekonstruktion kann verwendet werden, da die Daten nun zu einem Standard-Tilt-Serie reduziert wurde. In diesem Protokoll ist TomoJ used für Datenabgleich und Datenrekonstruktion 20, 21. Weitere Informationen darüber , wie TomoJ verwenden können 22 in der ursprünglichen Veröffentlichung. </li><li> Führen Sie eine Feinausrichtung der Tilt-Serie. HINWEIS: Eine gute Strategie ist Gold Perlen als Fiducial-Marker zu verwenden, um genau zu Verschiebungen zwischen den Bildern zu verfolgen. Lokale Minima können auch verwendet werden, wenn Goldkügelchen kann nicht zu der Probe gegeben werden. </li><li> Durchführen einer 3D-Rekonstruktion der ausgerichteten Daten; mehrere Algorithmen zur Verfügung stehen für die Rekonstruktionen im realen Raum oder Fourier-Raum durchführen, die jeweils mit Vor- und Nachteile. </li><li> Wenn die endgültige Ausrichtung der Tilt-Serie ist schlecht, einige Verbesserungen zu machen, indem sie die ersten Schritte zu optimieren. Halten die Ausrichtungsschritte, wenn die endgültige 3D-Rekonstruktion verschwommen erscheint oder deformiert; desto besser ist der Kontrast und die Details des 3D-Rekonstruktion in der Praxis, je größer die Anzahl der gesammelten Fokalebenen. HINWEIS: SeVeral Software-Programme können die Durchbrenn tilt-Serie zu verarbeiten verwendet werden. Allerdings sind die in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge wurden gewählt, weil in unserer Erfahrung, führten sie das Beste. TURBOREG 18 durchgeführt besser in Bezug auf die Ausrichtung der Bilder , wenn ein Gradient von Fokus vorhanden war. Weitere Informationen finden Sie auf der eigens eingerichteten Website 23 zu finden. Die Extended Depth of Field Plugin 19 entwickelte sich sehr gut in Bezug auf die In-Fokus - Informationen aus verschiedenen Bildern erholt, während andere Werkzeuge im sichtbaren Pixel Änderungen zur Folge. Weitere Informationen, insbesondere in Bezug auf Skript schreiben, finden Sie auf dieser speziellen Website 24 zu finden. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

We have no conflict of interest to disclose.

In diesem Artikel stellen wir eine konventionelle Probenvorbereitungsprotokoll zusammen mit einem Schritt-für-Schritt-Anleitung für die 3D-Analyse auf dicken biologischen Proben durchführen STEM durchBrennTomographie. Harz Einbettung von biologischen Proben ist seit Jahrzehnten 26 und alternative Protokolle verwendet, die auf unterschiedliche Arten von Proben geeignet sind , können in der gesamten 27 - Literatur gefunden werden. Im Gegensatz dazu Bildgebung dicken Prob...

Seit den frühen 1970er Jahren, Ansätze Tomographie in der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden weitgehend für die strukturelle Charakterisierung von biologischen Proben 1, 2, 3 verwendet. Die Anziehungskraft des Transmissionselektronentomographie war, dass es verwendet werden könnte, ein breites Spektrum von biologischen Strukturen im Nanometerbereich zu studieren, von der Architektur der Zellen und die Ultrastruktur von Organellen zu der Struktur von makromolekularen Komplexen und Proteinen. Dennoch könnte Transmissions-Elektronen-Tomographie nicht zu studieren, sehr dicke Proben verwendet werden (mehr als 0,5 &amp; mgr; m). Tatsächlich produzieren dicke Proben zu viele gestreute Elektronen zu erzeugen niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) Bilder. Darüber hinaus beinhaltet die Tomographie Sammlung von Bildern von gekippten Proben, mit der scheinbaren Dicke der Probe mit der Neigungswinkel erhöht wird. Obwohl kann die unelastische Streuung gefiltert werdenEnergiefilter geführt, wobei die kritische Menge an Elektronen für hohe SNR Bilder benötigt wird, kaum in TEM erreicht. Daher haben dicke biologische Proben nur untersucht worden sectioning 4 verwendet wird . Einige Proben können nicht geschnitten werden: einige verschlechtern könnten, wenn sie geschnitten werden, und andere müssen in ihrer Gesamtheit untersucht, um zu ihrer Komplexität zu verstehen. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung TEM in Abtastmodus 5, 6, 7, 8. In Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM), die optische Weglänge der Elektronen unterscheidet sich von dem in konventionellen TEM. Elektronen durch die Probe ohne Streuung hindurchtritt, mit einem Hellfeld- (BF) Detektor 9, während die gestreute elastisch in einem bestimmten Winkel von der optischen Achse mit einem Dunkelfeld (DF) -Detektor gesammelt auf der optischen Achse gesammelt werden kann.Der andere Vorteil der STEM ist, daß der fokussierte Elektronenstrahl an der Oberfläche der Probe abgetastet wird, wodurch die Pixel-für-Pixel-Sammlung der Bilder. Auch wenn der Elektronenstrahl während verbreitert 10 durch die Probe vorbei, diese besondere Sammelsystem ist weniger anfällig für unelastisch gestreute Elektronen als herkömmliche TEM. Darüber hinaus gibt es keine Linse post-Probe in STEM, wodurch die chromatischen Aberrationen zu vermeiden, die in TEM auftreten können. Die Kameralänge kann eingestellt werden, so daß der Detektor hauptsächlich BF ungestreute Elektronen detektiert. Mit dem DF-Detektor dicken Proben zu studieren ist nicht wegen der Mehrfachstreuung empfohlen, die ungenaue Bilder erzeugt. Stattdessen kann der BF - Detektor 11 verwendet werden. Während STEM hohe SNR Bilder erzeugen kann, hat es eine relativ geringe Schärfentiefe-Bereich aufgrund des relativ hohen Strahlkonvergenz im Vergleich zu TEM, die Menge der eingehenden Informationen abnimmt, die von dicken wiederhergestellt werden könnenProben. Im Falle von fehlerkorrigierten STEM Mikroskope, wo der Konvergenzwinkel so hoch wie 30 mrad sein kann, kann die Tiefe des Feldes niedrig genug sein, so dass die Informationen, die in Fokus von einer Brennebene stammt von nur wenigen Nanometern . Einstellen des Elektronenstrahls im Parallelbetrieb bis erhöht die Schärfentiefe-Bereich des Elektronenstrahls zu Lasten der Auflösung 12. Allerdings ist diese Einstellung nicht immer möglich. Wann immer es notwendig ist, einen konvergenten Elektronenstrahl zu verwenden, muss man Techniken verwenden, die die Tiefe der Bereich des Elektronenstrahls erhöhen, wenn dicke Proben zu studieren. Jüngste Studien haben die Übernahme von mehreren Bildern an verschiedenen Fokusebenen in der gesamten Probe angegeben in-focus die maximale Menge an Informationen wiederherzustellen 13, 14. Die beiden Studien beschreiben verschiedene Möglichkeiten, um die Informationen aus den verschiedenen Fokusebenen zu behandeln. Hovden et al.im Fourierraum kombiniert , um die Bilder , die bei verschiedenen Brennebenen gesammelt wurden, und die endgültige Rekonstruktion wurde direkt aus dem 3D inverse Fourier - Transformation 13 erhalten. Im Gegensatz dazu Dahmen et al. eine konvergente Strahlrekonstruktionsmaschine entwickelt , um das 3D - Volumen aus den verschiedenen Brennebenen 14 im realen Raum zu rekonstruieren. Unser Labor entwickelt auch ein Verfahren zur Abbildung dicken biologischen Proben. Unsere Strategie war anders als die beiden oben beschriebenen Verfahren, dass wir die Informationen zusammengefasst , die in den verschiedenen Brennebenen fokussiert ist und rekonstruiert die endgültige 3D - Volumen im realen Raum einen parallelen Strahl Projektor 15 verwendet wird . Unser Ziel war es, ein Verfahren zu entwickeln, die leicht in jeder Elektronenmikroskopie Labor durchgeführt werden kann. Zu diesem Zweck war es unser Ziel, die Brenn Bilder in einer begrenzten Zeit, vergleichbar mit dem Zeitrahmen von herkömmlichen Tomographie Experimenten zu sammeln. Darüber hinaus ist unsere vorgeschlagene Verfahren could für die Verwendung mit verschiedenen Arten von Ausrichtung und Rekonstruktionssoftware angepasst werden. Im Rahmen unserer Veröffentlichung ab dem Jahr 2015 15, wollten wir die Erholung der depth-of-field zu visualisieren und zu charakterisieren, so haben wir eine große Konvergenz Halbwinkel von 25 mrad. Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll zur Durchführung einer Durchbrenn Bildgebung in STEM nach der Methode entwickelt in unserem Labor im Jahr 2015 15, und wir präsentieren , wie die Daten von 2015 verarbeitet wurde. Diese Methode erholt sich im Fokus befindlichen Informationen aus mehreren Fokusebenen über einen dicken (750 nm) biologischen Probe und ermöglicht qualitativ hochwertige 3D-Rekonstruktionen. Gegebenenfalls sind die Unterschiede in dieser Methodik im Vergleich zu den Methoden, die von anderen Gruppen verwendet werden ebenfalls vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxyde</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Capsule</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Triming and Histo knives</td><td>LFG Distribution</td><td>Diatome diamond knives</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy copper grid</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Grid Coating Pen</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Holder</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

In unserer Studie wurden die Elektronen 200 kV in der Feldemissionskanone Transmissionselektronenmikroskop beschleunigt. Die Bilder wurden in MINT-BF-Modus unter Verwendung eines 20-us Verweilzeit gesammelt. In Bezug auf die Gestaltung der Durchbrenn Tilt-Serie, fanden wir, dass der Fokus Abstand von 150 nm für die ultrastrukturelle Untersuchung einer 750 nm dicken biologischen Probe-obwohl die Tiefe der Bereich des Elektronenstrahls nur befriedigende Ergebnisse gab, war 3 nm-da wir ein...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Aufrufe.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Serie: Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of the woodboring beetle, Chlorophorus caragana Xie &#38; Wang (2012), for both types of electron microscopy. The scanning electron microscopy (SEM) sample preparation protocol was based on sample chemical fixation, dehydration in a series of ethanol baths, drying, and sputter-coating. By adding Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) to the fixative and the wash solution, the insect body surface of woodboring beetle was washed more cleanly in SEM. This study&#39;s transmission electron microscopy (TEM) sample preparation involved a series of steps including fixation, ethanol dehydration, embedding in resin, positioning using fluorescence microscopy, sectioning, and staining. Fixative with Tween 20 enabled penetrate the insect body wall of woodboring beetle more easily than it would had been without Tween 20, and subsequently better fixed tissues and organs in the body, thus yielded clear transmission electron microscope observations of insect sensilla ultrastructures. The next step of this preparation was determining the positions of insect sensilla in the sample embedded in the resin block by using fluorescence microscopy to increase the precision of target sensilla positioning. This improved slicing accuracy.

In order to observe ultrastructure of insect sensilla, scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM, respectively) sample preparation protocol were presented in the study. Tween 20 was added into the fixative to avoid sample deformation in SEM. Fluorescence microscopy was helpful for improving slicing accuracy in TEM.

Probenvorbereitungsmethode des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops für die Anhänge von Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...

Forschung

Umwelt

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Ingenieurwesen

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Biotechnik

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biologie

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryo-STEM tomography provides a means to visualize organelles of intact cells without embedding, sectioning, or other invasive preparations. The 3D resolution obtained is currently in the range of a few nanometers, with a field of view of several micrometers and an accessible thickness in the order of 1 &#181;m.