Name: preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography at JoVE.com

This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

주의 : 사용하기 전에 각종 시약의 물질 안전 보건 자료 (MSDS에) 참조하십시오. 시료 전처리 과정에 사용되는 화학 물질의 일부 ​​및 / 또는 생식 독성, 발암 성 독성, 돌연변이이다. 샘플을 처리하는 동안 흄 후드 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발) 작업을 사용합니다. 을 Ultramicrotome 시료를 단면 예리한 도구의 사용을 포함하고, 이러한 도구주의 사용은 필수이다. 후술하는 단계에서, 저자는 시료 세포 배양 샘플이라고 가정한다. 프로토콜은 샘플 유형 특히 원심 분리 단계에 따라 수정 될 필요가있다. 버퍼와 혼합물의 제조 1. <ol><li> 인산 완충 용액 (PBS) 용액을 준비한다 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 및 1.76 mM의 KH 2 PO 4). </li><li> 30 %, 50 %, 70 % 등을 함유하는 용액을 준비샘플 탈수 PBS에서 한올. 점차적으로 에탄올 농도를 증가의 샘플을 배양하여 샘플 탈수를 수행합니다. </li><li> (숙신산 무수물 (9 ㎖), 메틸 -5- 노르 보르 넨 -2,3- 디카 르 복실 산 (11 mL)에 2,4,6- 트리스 도데 세닐 비스페놀 A- (에피 클로로 히 드린) (20 ㎖)을 혼합하여 에폭시 수지를 준비 디메틸 아미노 메틸) 페놀 (0.7 ㎖); 다른 혼합 비율은 수지의 원하는 경도에 따라 사용될 수있다. </li><li> 샘플 매립 에탄올 30 %, 50 %, 70 %의 에폭시 수지를 함유하는 용액을 준비한다. 서서히 수지 농도의 증가와 함께 샘플을 배양하여 수지 매립을 수행한다. 주 : 준비된 솔루션의 볼륨이 연구되고있다 샘플의 유형에 따라 달라집니다. 추가 용액을 세포 배양에 비해 조직 필요하다. </li></ol> 샘플 2. 고정 및 착색 <ol><li> g X 5000에서 5 분 동안 세포 배양을 원심 분리기. 동일한 조건을 사용하여 다음 회 원심을 모두 수행한다.</li><li> 뜨는을 취소하고 4 % 파라 포름 알데히드와 2 % 글루 타르 알데히드와 PBS (1 ㎖)에 그것을 재현 탁하여 세포 펠렛을 수정합니다. 30 분 (도 1a)을 실온에서이를 부화. 또한, 야간 또는 주말에 4 ° C에서 세포를 고정합니다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 완전히 정착 제를 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척 하였다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 PBS (1 mL) 중에 1 % OSO 4 샘플 포스트 픽스. </li><li> 원심 분리 후, 상층 액을 제거하고 완전히 OSO 4 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 반복한다. 석유 및 폐기에 OSO 4를 비활성화합니다. </li><li> 조영제로서 PBS (1 mL) 중 2 % 우라 닐 아세테이트를 첨가하고, 실온 (도 1b)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 미 결합 우라 닐 AC를 제거하는 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척etate; 우라 닐 아세테이트는 방사성 원소를 포함하고 방사성 폐기물 전용 bin에의 배치해야합니다. 주의 : 샘플의 크기에 따라 배양 시간을 변경할 수있다. 예를 들어, 고정 및 조직 샘플과 같은 두꺼운 샘플 염색의 경우, 더 이상 배양 시간을 필요로한다. 긴 배양 시간은 탈수 및 매립 단계를 더 좋을 수있다. 우라 닐 아세트산 가돌리늄 염을 포함하는 &quot;우라 닐리스&quot;솔루션으로 대체 될 수있다. </li></ol> 3. 샘플 탈수 <ol><li> 원심 분리 후 상층 액을 버리고 30 % 에탄올로 PBS에 39 ° C (1 ㎖) (도 1C)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 점차 상승 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 100 %까지) 용액을 사용하여 반복 스텝 3.1. 이러한 탈수 단계 동안, 샘플 보존을 위해 4 ℃에서 시료를 유지한다. </li><li> 원심 분리 후, supernat 폐기개미와 순수 에탄올 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li></ol> 4. 수지 퍼가기 <ol><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 RT (도 1D)에서 30 분 동안 30 %의 에폭시 수지 (1 mL)을 에탄올에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 점차 상승 에폭시 수지 농도의 용액을 사용하여 반복 스텝 4.1 (50 %, 70 %, 100 %까지). </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 순수 에폭시 수지 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; RT에서 하룻밤을 품어. 수지의 중합을 실행할 수 DMP-30 경화의 존재; 이 경우, 에폭시 수지의 두 배치, 하나와 DMP-30없이 하나를 준비합니다. </li><li> 원심 분리 후, 순수 에폭시 수지의 200 μL 플라스틱 캡슐 (경화제를 포함)에 펠렛을 재현 탁; 샘플은 플라스틱 캡슐의 바닥에 있어야합니다. </li></ol> 5. 수지 중합 <ol><li> 나는48 시간 동안 60 ℃로 설정된 항온 시료를 함유하는 플라스틱 캡슐 ncubate; 수지의 다른 종류의 서로 다른 설정으로 중합 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 캡슐을 제거하고 수지를 중합 있는지 확인; 하드 표면에 누를 경우 수지 열심히해야한다. </li><li> 샘플을 함유하는 중합 된 수지 위에 (경화제 포함) 순수 에폭시 수지를 추가; 수지의이 한층 더 쉽게 샘플을 잘라 만들 것입니다. 48 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 캡슐. </li></ol> 6. 샘플 단면 <ol><li> 샘플 상단을 향해되도록 시편 홀더의 샘플 거꾸로 장착하고을 Ultramicrotome의 트리밍 블록에 고정합니다. 단단히을 Ultramicrotome에 트리밍 블록을 확보하기 위해 레버를 잠급니다. </li><li> 면도날 또는 유사한 날카로운 절단 공구를 사용하여 중합 된 수지를 분리하는 플라스틱 캡슐을 잘라. 샘플이 포함되도록 수지 컷피라미드의 약 모양 수지 에디션. 전체 플라스틱 캡슐을 제거 할 필요는 없다; 단지 중합 샘플을 덮고있는 부분을 제거합니다. </li><li> 캡슐 및 트리밍 블록의 오프 시편 홀더를 타고을 Ultramicrotome의 이동 팔에 설치합니다. </li><li> 칼 블록에 트리밍 나이프를 설치하고 정확하게 피라미드의 얼굴을 잘라. 쌍안경의 사용은 피라미드에 대한 완벽한 모양을 제공하는 것이 좋습니다; 피라미드 더 나은, 더 나은 부분이 될 것입니다. </li><li> 트리밍 칼을 벗고 두꺼운 0.5 μm의있는 부분을 절단하는 데 사용할 수있는 조직학 나이프로 교체합니다. </li><li> 물의 정확한 양 조직학 칼 큐벳을 충전 한 후, 시료의 표면에 칼의 칼날을 가지고 상기 칼 피라미드 수직 슬라이스되도록 캡슐 피치 각을 조정 망원경을 사용한다. </li><li> 목적에 따른 절삭 속도를 조정섹션 두께는 균일 한 부분을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 물 위에 섹션 플로트를하자 루프와 물고기. </li><li> 여과지 위에 배치 된 전자 현미경 구리 그리드 향해 루프를 이동한다. 주 : 그리드는 친수성을 증가시키기 위해 이전에 처리 된 것이다. 이것은 격자 코팅 펜으로 수행 될 수있다. </li><li> 때문에 여과지로 물 흡수 섹션 그리드에 충실 할 수 있습니다. 전자 현미경에 삽입하기 전에 몇 분 동안은 건조 보자. </li></ol> 관통 초점 기울기 시리즈의 7 디자인 <ol><li> 일정한 초점 간격으로 관통 초점 이미지를 수집합니다. 참고 : 관통 초점 틸트 시리즈는 기울기 시리즈의 각각의 경사 각도에서 수집 관통 초점 이미지 세트로 구성되어 있습니다. 전체 포커스 진폭은 전체 샘플 두께를 커버하기에 충분해야한다. </li><li> 초점 간격의 값을 결정한다. 간격은 D 같으면epth-의 필드, 초점 전체 샘플을 수집; 이 설정은 가능한 가장 높은 샘플링을 나타냅니다. 간격이 심도보다 큰 경우, 샘플의 일부분이 샘플의 일부가 초점이 수집되지 않을 것임을 의미하는 포커스에서 취득되지 않는다. </li><li> 피사계 심도 전자의 파장에서 전자 빔 및 전자 빔의 수렴 반각의 계산. 전자의 파장 직접 가속 전압에 연결되는 반면, 전자 현미경 제조자의 수렴 반각을 사용하거나 공지의 시편 (16)의 회절 패턴으로부터 실험적으로 결정한다. 전자는 파장 λ에서 가속 때문에 전자 현미경에서 α의 수렴 반각으로 샘플 충돌, 피사계 심도 (DOF)를 결정하기 위해 다음 식을 사용 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> 디자인전체 초점 진폭이 최대 명백한 두께의 샘플을 충당 할 수 있도록 초점 시리즈 (즉, 가장 높은 경사에서). 참고 : 초점 크기보다 큰 2.19 μm의를해야합니다 그래서 0.75 μm의 두께 샘플, 70 ° 경사에서 2.19 μm의 겉보기 두께를해야합니다. 상기 결정된 포커스 간격은 50 나노 미터와 동일한 경우,이 시료를 들어, 그것은 최대 겉보기 두께 샘플을 커버 (44)와 이미지 (2.19 μm의 / 50 나노 미터)를 필요로한다. 전체 포커스 진폭은 초점 단계의 수를 곱한 포커스 구간의 값과 같다. 최대 기울기 (θ)에서, 샘플 겉보기 두께는 다음과 같이 정의된다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. 샘플 영상 참고 :이 STEM 모드에서 전자 현미경을 설정하는 방법을 설명하기 위해이 프로토콜의 범위를 벗어납니다; 이 정보의 대부분은 찾을 수 있습니다 내가n은 레퍼런스 매뉴얼은 전자 현미경 제조업체에서 제공. 그러나, 다음 참고 : I)의 스폿 사이즈는 원하는 배율에 따라 선택되어야한다; ⅱ) Ronchigram은 잘 정렬되어야합니다; 및 ⅲ) BF 모드에서 카메라 길이 검출기의 양호한 조명을 유지하면서 unscattered 전자를 선택하도록 조정되어야한다. 전자 현미경으로 구리 그리드 상에 퇴적 수지 부분 수축을 방지하는 화상 취득 전에 점등한다. 수지의 수축 및 충전 효과는 이미지 수집시 혼동 될 수 있습니다. 충전 효과가 발생 될 때 대물 렌즈의 구경의 사용은 샘플의 안정성을 향상시킬 수있다. 그러나 STEM 셋업의 특정한 경우에, 대물 조리개 HAADF 촬상 모드와 호환되지 않으며, 매우 작은 개구가 대물 BF 촬상 모드와 호환되지 않는다. <ol><li> 낮은 배율 (STEM에 20,000X 약)를 사용하여 샘플을 통해 검색하고 관심 영역을 찾습니다. </li><li> t를 조정샘플을 회전시키면서 관심 영역이 표류하지 않도록 그 높이 (Z 축) eucentric. </li><li> 관심의 대상이 전체 틸트 범위에서 볼 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 때문에 관통 초점 경사 계 중에 획득 된 이미지의 상당한 수에 자동 수집 소프트웨어를 사용한다. 어느 상용 솔루션을 사용하거나 원하는 경우 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어를 설계합니다. 소프트웨어 프로그램은 다음 세 단계를 수행 할 수 있는지 확인합니다 : <ol><li> 추적 및 표준 틸트 시리즈 수집 방식에서와 같이 초점을 맞추고있다. </li><li> 관통 초점 이미지가 샘플의 Z-위치와 중복 있는지 확인합니다. </li><li> 자동으로 각 경사각 관통 초점 일련의 이미지를 획득. </li></ol></li><li> 소프트웨어 프로그램을 관통 초점 경사 계의 주 변수를 제공 (즉, 초점 간격 초점 단계, 최소 경사각의 최대 경사 각도, 경사 공정과, 주사 속도). </li><li> 스타트소프트웨어 프로그램이 완료 될 때까지 화상 수집 처리 및 대기. </li></ol> 9. 이미지 처리 주 :이 프로토콜에서, 관통 초점 경사 계 처리 ImageJ에 플러그 (17)를 사용하여 수행된다. 보충 자료 1 정렬 단계 (Turboreg)과 세 개의 초점 값으로 설계된 관통 초점 틸트 - 시리즈 - 포커스 정보 (필드의 확장 깊이) 병합에 대한 ImageJ에 매크로를 보여줍니다. <ol><li> 동일한 경사각 (즉, 관통 초점 이미지)에서 수집 된 이미지를 맞 춥니 다. 이미지는 동일 합초 정보를 가지고 있지 않기 때문에, 이들은 정렬 동일한 기능 항구하지 않는다; 이웃 이미지를 두 가지로 두 가지를 정렬하여 정렬을 수행 (즉, 먼저 가장 가까운 초점 값으로 피라미드 계층 구조, 다음) Turboreg 18 ImageJ에 플러그인을 사용합니다. </li><li> 일관 각 경사각 관통 초점 이미지의 정렬을 확인.육안 검사를 개선하기 위해 정렬 관통 초점 이미지를 스택. 참고 : 스택을 통해 탐색하는 동안 만 영역에 초점이 이동해야합니다. 다음 단계는 다른 이미지의 초점이 정보의 복구 구성 때문에 정확한 정렬은 가장 중요하다. </li><li> 필드 (19), ImageJ에 플러그인의 확장 깊이를 사용하여 초점에있는 정보를 병합; 이것은 결국 이미지의 스택에서 하나의 이미지를 생성합니다. 몇몇 설정이 심도를 복구하는 동안 사용되지만, 화상 정보를 보존하는 최고 설정을 사용할 수있다. 주 : 틸트 계 이제 경사각 당 하나의 화상으로 구성되고, 합초 정보를 포함하는 각 이미지는 관통 초점 화상으로부터 회수. </li><li> 데이터를 처리합니다. 참고 : 데이터가 이제 표준 기울기 시리즈로 감소되어 있기 때문에 정렬 및 재건을위한 표준 도구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 TomoJ 우리를이다ED 데이터 정렬 및 데이터 재구성 (20), (21). TomoJ를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 해당 출판물 (22)에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 기울기 시리즈의 미세 정렬을 수행합니다. 참고 : 좋은 전략은 정확하게 이미지 사이의 변화를 추적하는 기준 마커로 골드 비즈를 사용하는 것입니다. 골드 비드 샘플에 첨가 할 수없는 경우에 로컬 최소치가 사용될 수있다. </li><li> 정렬 된 데이터의 3 차원 재구성을 수행한다; 여러 가지 알고리즘은 실제 공간이나 푸리에 공간, 장점과 한계 각각의 복원을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 틸트 시리즈의 최종 배향 불량 인 경우, 초기 단계를 최적화하여 약간 개선 할. 최종 3 차원 복원이 흐리거나 변형 나타나는 경우 정렬 단계를 반복; 실제로 수집 초점 평면의 큰 수, 더 나은 콘트라스트 및 3D 재구성 세부. 참고 : 괜찮다veral 소프트웨어 프로그램 관통 초점 경사 계를 처리하기 위해 사용될 수있다. 그러나,이 프로토콜에 사용되는 도구가 선택되었다 때문에, 우리의 경험, 그들은 최고의 수행. Turboreg 18 초점의 구배가 존재하는 경우 이미지를 정렬의 관점에서 더 나은 수행. 자세한 내용은 전용 웹 사이트 (23)에서 찾을 수 있습니다. 다른 도구가 표시 픽셀 수정 결과 반면 필드 플러그인 (19)의 확장 깊이, 서로 다른 이미지에서의 초점 정보를 복구 측면에서 매우 잘 수행. 자세한 내용은, 특히 관련 스크립트 작성이 전용 웹 사이트 (24)에서 찾을 수 있습니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy.">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li><li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ettention+software+package.">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography.">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles.">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li><li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

We have no conflict of interest to disclose.

이 글에서, 우리는 관통 초점 단층 촬영 STEM을 사용하여 두께의 생물학적 시료에서 3D 분석을 수행하기위한 단계별 가이드와 함께 기존의 샘플 준비 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시료의 수지 매립은 수십 26에 사용되었으며, 시료의 종류에 맞게 다른 프로토콜은 문헌 (27)을 통해 찾을 수있다. 대조적으로, STEM에 영상 두꺼운 표본은 새로운 사업을 통해 초점 ?...

1970 년대 초반 이후 단층 널리 생물학적 시료 1, 2, 3의 구조적 특성에 사용 된 투과형 전자 현미경 (TEM)에 접근한다. 투과형 전자 단층의 매력이 전지의 구조 및 고분자 복합체 단백질의 구조 내 소기관의 미세 구조에서, 나노 스케일에서 생체 구조의 광범위한 연구하는 데 사용할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 투과형 전자 단층은 매우 두꺼운 샘플 (이상이 0.5㎛)을 연구하기 위해 이용 될 수 없었다. 실제로 두께 시험편 낮은 신호대 잡음비 (SNR)의 이미지를 생성하는 너무 많은 산란 전자를 생성한다. 또한, 단층의 경사각 증대 시료의 겉보기 두께, 기울어 진 시험편의 이미지의 컬렉션을 포함한다. 심지어 비탄성 산란을 필터링 할 수 있습니다하지만에너지 필터를 사용하여, 높은 SNR 이미지에 필요한 전자의 임계량 거의 TEM에 도달한다. 따라서, 생물학적 시료의 두께는 단지 4 절편하여 연구되어왔다. 들이 절단 될 때 약간 저하 될 수도 있고, 다른 복잡성을 이해하기 위해 그 전체 연구 할 필요 일부 샘플은 분리 될 수 없다. 다른 방법은 스캔 모드 5, 6, 7, 8의 TEM을 사용하는 것이다. 투과 전자 현미경 (STEM)를 스캐닝, 전자의 광로가 종래의 TEM에서 다르다. 탄성 산란 그는 어두운 필드 (DF) 탐지기와 광축으로부터 소정의 각도에서 수집 될 수있는 반면 산란없이 샘플을 통과하는 전자는 밝은 필드 (BF) 검출기 (9)의 광축 상에 수집 될 수있다.STEM의 또 다른 장점은 집속 전자 빔 이미지의 픽셀 별 수집을 가능하게 시료의 표면에 주사되어있다. 시료 (10)를 통과하면서 전자빔이 넓어진 경우에도 특정 컬렉션 기법은 종래의 TEM 비탄 성적으로 산란 전자보다 덜 민감하다. 또한, TEM에 따라서 발생할 수있는 색수차 회피 STEM에는 렌즈 후의 시험편 없다. BF 검출기는 주로 unscattered 전자를 검출하도록 카메라 길이를 조정할 수있다. 두꺼운 샘플을 연구하기 위해 DF 검출기를 사용 때문에 부정확 한 이미지를 생성 다중 산란,하지 않는 것이 좋습니다. 대신, BF 검출기 (11)를 사용할 수있다. STEM 높은 SNR 이미지를 생성 할 수 있지만, 두께로부터 회수 될 수 깊이있는 정보의 양이 감소하기 때문에 TEM에 비하여 상대적으로 높은 광 수렴 비교적 낮은 심도를 갖고표본. 초점이 정보가 몇 나노 미터의 초점면에서 유래되도록 수렴 각도가 30 MRAD만큼 높을 수있는 수차 보정 STEM 현미경의 경우, 피사계 심도는 충분히 낮을 수있다 . 병렬 모드에 전자선을 설정하면 심도 전자빔의 해상도 (12)의 손해를 향상시킨다. 그러나,이 설정이 항상 가능한 것은 아니다. 이 수속 전자빔을 사용하는 것이 필요할 때마다, 하나의 두꺼운 샘플을 연구 할 때 심도 전자빔의 향상 기술을 사용한다. 최근 연구의 초점 정보 (13), (14)의 최대 양을 복구하는 시료에 걸쳐 다양한 초점 평면에서 다수의 이미지의 취득을보고 하였다. 두 연구에서 상이한 초점 평면의 정보를 처리하는 다양한 방법을 설명한다. Hovden 등은.다양한 초점 평면에서 수집 된 이미지는 푸리에 공간에서 결합하고 최종 재구성 13 변형 차원 역 푸리에로부터 직접 얻었다. 이에는 DAHMEN 외. 실 공간의 다양한 초점 평면 (14)로부터의 3 차원 볼륨을 재구성 수렴 빔 복원 엔진을 개발했다. 본 연구실은 두꺼운 생물학적 시료를 이미징하는 방법을 개발 하였다. 우리의 전략은 우리가 다양한 초점 평면에서 초점이 정보를 병합하고, 평행 광선 조사 장치 (15)를 이용하여 실 공간에서의 최종 3 차원 볼륨을 복원한다는 점에서 상기 한 두 방법과 다르다. 우리의 목표는 쉽게 전자 현미경 실험실에서 수행 될 수있는 방법을 개발 하였다. 이를 위해 종래의 단층 실험의 시간 프레임에 필적 ​​제한된 시간에 촛점 이미지를 수집 할 목적. 또한, 제안 된 방법 C정렬 및 재구성 소프트웨어의 종류와 사용하기 위해 적응 될 울드. 2015 15 우리 출판물의 맥락에서, 우리는 시각화와 피사계 심도의 회복을 특성화하고 싶었다, 그래서 우리는 25 MRAD의 큰 수렴 반 각도를 사용했다. 여기서는 2015 년 15 실험실에서 개발 된 방법에 따라 STEM에 관통 초점 촬상 행하는 단계별 프로토콜을 제공하고, 우리는 2015에서의 데이터 처리 방법을 제시 하였다. 이 방법은, 두께 (750 ㎚) 생물학적 샘플에 걸쳐 여러 초점 평면에서 초점 정보를 복구하고 고품질의 3D 재구성을 가능하게한다. 어디 관련, 다른 그룹에서 사용하는 방법에 비해이 방법의 차이도 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxyde</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Capsule</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Triming and Histo knives</td><td>LFG Distribution</td><td>Diatome diamond knives</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy copper grid</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Grid Coating Pen</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Holder</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

우리의 연구에서, 전자는 전계 방출 총 투과형 전자 현미경 200 kV의 가속되었다. 이미지는 20 μs의 지속 시간을 사용하여 줄기 BF 모드로 수집되었다. 관통 초점 틸트 시리즈의 디자인에 관해서는, 우리는 750 nm 두께의 생물학적 샘플도 전자빔의 피사계 심도가 있었지만 단지의 미세 구조 연구에 대한 만족스러운 결과를 준 내지 150 nm의 초점 간격을 발견 3 nm의 때문에 우리는...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

preparation-observation-thick-biological-samples-scanning

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K 조회수.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

비디오: Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of the woodboring beetle, Chlorophorus caragana Xie &#38; Wang (2012), for both types of electron microscopy. The scanning electron microscopy (SEM) sample preparation protocol was based on sample chemical fixation, dehydration in a series of ethanol baths, drying, and sputter-coating. By adding Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) to the fixative and the wash solution, the insect body surface of woodboring beetle was washed more cleanly in SEM. This study&#39;s transmission electron microscopy (TEM) sample preparation involved a series of steps including fixation, ethanol dehydration, embedding in resin, positioning using fluorescence microscopy, sectioning, and staining. Fixative with Tween 20 enabled penetrate the insect body wall of woodboring beetle more easily than it would had been without Tween 20, and subsequently better fixed tissues and organs in the body, thus yielded clear transmission electron microscope observations of insect sensilla ultrastructures. The next step of this preparation was determining the positions of insect sensilla in the sample embedded in the resin block by using fluorescence microscopy to increase the precision of target sensilla positioning. This improved slicing accuracy.

In order to observe ultrastructure of insect sensilla, scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM, respectively) sample preparation protocol were presented in the study. Tween 20 was added into the fixative to avoid sample deformation in SEM. Fluorescence microscopy was helpful for improving slicing accuracy in TEM.

목공 딱정벌레의 부속물을 위한 주사 및 투과 전자 현미경의 시료 제조 방법

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...

연구

환경과학

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

공학

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

생체공학

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

생물학

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.