Wir haben standardisierte Probenvorbereitungsprotokolle für bildgebungsgemalte Schildkrötenembryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen mittels Rasterelektronenmikroskopie. Diese umfassenden Methoden verwenden subtile Änderungen an bekannten Protokollen, um drei empfindliche Gewebe zu verarbeiten, die die Unterscheidung zwischen Originalstrukturen und die Verarbeitung der Artefakte ermöglichen. Mit mir wird Jessica Gibbons, eine Studentin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren.
Bevor Sie während der Brutzeit Schildkröteneier von einem Feldplatz sammeln, machen Sie vier bis sechs 0,25 Zentimeter große Löcher an den Seiten von Plastikboxen und auf ihren Deckeln, um belüftungzuermöglichen. Vor dem Befüllen der Kisten mit einer feuchten Mischung aus Vermiculit und Torfmoos-Bettmischung im Verhältnis eins zu eins. Entfernen Sie an der Niststelle vorsichtig den Boden, um die Eier aufzudecken, und wischen Sie die Oberfläche jedes Schildkröten-Eis mit einer verdünnten Jodtinktur ab, um sich vor mikrobiellen Verunreinigungen während der Inkubation zu schützen.
Legen Sie maximal acht bis neun Eier pro Schachtel in die gleiche Ausrichtung und Ausrichtung, wie sie gelegt wurden, wobei einzelne Kupplungen voneinander getrennt sind. Wenn alle Eier gesammelt wurden, legen Sie die Eier manuell in die Bettwäsche und legen Sie die Deckelboxen für 10 bis 17 Tage in einen 30-Grad-Grad-Inkubator, um die embryonalen Stadien 12, 13 bzw. 18 Embryonen zu erhalten. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Einstreumedium jeden zweiten Tag teilweise zu befeuchten, um Austrocknung zu vermeiden und den Feuchtigkeitsgehalt für die normale Embryoentwicklung aufrechtzuerhalten.
Verwenden Sie in der entsprechenden Entwicklungsphase eine spitze Schere, um einen Schnitt auf eine Seite der dorsalen Eierschale und der Eigelbmembran zusammen zu machen, vertikal zur langen Achse des Eis. Als nächstes schneiden Sie die andere Seite des Eis entlang der kurzen Achse, und verwenden Sie Zangen, um das ausgeschnittene Stück mit der Embryoseite nach oben zu schälen. Schneiden Sie die andere Seitliche Seite der Eierschale und legen Sie das ausgeschnittene Stück Schale in PBS.
Mit einem Stereomikroskop und Zangen, schälen Sie den Embryo und Diegelbmembran von der Eierschale. Verwenden Sie die Zange und Mikroschere, um die extra embryonalen Membranen zu entfernen, und verwenden Sie einen Embryolöffel, um den Embryo in eine Petrischale mit frischem PBS zu übertragen. Nach dem Abwaschen von Blut und Eigelb bis zu drei Embryonen pro Brunnen einer 12-Well-Platte, die 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius für zwei bis drei Tage enthält.
Wenn die Proben weiß erscheinen, verwenden Sie Polystyrol-Einsätze mit Polyester-Mesh-Unterteilen, um die Embryonen mit drei fünfminütigen Waschungen in frischen PBS pro Wäsche zu spülen. Nach der letzten Wäsche Proben in einer aufsteigenden Ethanolserie für eine Stunde pro Konzentration dehydrieren. Nach dem zweiten Ethanol-Eintauchen trocknen Sie die Embryonen in einer Reihe von HMDS zu Ethanolkonzentrationen für 20 Minuten pro Eintauchen mit den Petri-Schalen teilweise abgedeckt.
Dann legen Sie die Embryonen in eine endgültige 100%HMDS-Lösung, ganz oder teilweise mit einer Dunstabzugshaube über Nacht bedeckt. Langsames Trocknen durch allmähliche Erhöhung der Konzentration von HDMS auf Ethanol ist wichtig, um eine ausgezeichnete Oberflächenstruktur in den Embryonen zu offenbaren. Verwenden Sie am nächsten Morgen doppelstabige sediebelbares Klebeband, um die vollständig getrockneten Proben sorgfältig auf einem Standard-Aluminium-Stift-Stub zu montieren.
Wenn alle Proben montiert sind, führen Sie die Proben in die Sputter-Coater-Kammer ein, um die Proben mit einem sehr dünnen Goldfilm für 60 bis 120 Sekunden bei einem 35-Milliamp-Spututter zu beschichten. Befestigen Sie dann die Stellschrauben, um die Stummel auf die entsprechenden Gießplatten zu montieren. Verwenden Sie das Probenaustauschwerkzeug, um den Probenhalter zur Bildgebung in die Probenkammer des Rasterelektronenmikroskops zu übertragen.
Um Eierschalen für die Rasterelektronenmikroskopie vorzubereiten, legen Sie die Eierschalen mindestens eine Stunde nach der Embryoernte in destilliertes Wasser, um jegliche Dotter- oder Albuminkontamination zu beseitigen. Als nächstes trocknen Sie die gereinigten Eierschalen auf empfindlichen antistatischen Tüchern in der Dunstabzugshaube über Nacht an die Luft. Bewahren Sie die getrockneten Eierschalen in sauberen Probenflaschen auf, die nach Anzahl und Embryostadium gekennzeichnet sind.
Dann montieren, sputtern Mantel und Bild der Eierschalen Proben, wie gerade für die Embryonen gezeigt. Um Gleitpilzkulturen zu etablieren, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um halb bis drei Viertel Zoll Blöcke fester Kartoffeldextrose Agar zu schneiden, und legen Sie die Blöcke auf einzelne Glasmikroskop-Dias. Legen Sie sterile Zahnstocher auf den Boden der sauberen Petrischalen, um die Rutschen von ihnen zu heben, um Oberflächenspannungen zwischen der Platte und der Rutsche zu erzeugen.
Legen Sie jede Rutsche auf die Zahnstocher in der Petrischale. Als nächstes verwenden Sie eine sterile Schleife, um Pilze von der Probe inoculum auf jede der vier Seitenseiten eines Agarblocks zu übertragen. Fügen Sie ein paar Tropfen steriles destilliertes Wasser in die Petrischale um die Rutsche, um Feuchtigkeit für die wachsenden Pilze zu gewährleisten.
Versiegeln Sie die Platte teilweise mit Paraffinfolie und legen Sie die Platte im 30 Grad Celsius Inkubator für die entsprechende Brutzeit für die Pilzarten. Am Ende der Inkubation entfernen Sie die Rutsche von der Petrischale und verwenden Sie sterile Zangen, um den fest haftenden Agarblock von der Rutsche in einen Behälter mit 3% Glutaraldehyd für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius zu übertragen. Am nächsten Morgen die Proben in einer aufsteigenden Ethanolserie für 15 Minuten pro Konzentration dehydrieren.
Nach dem 90%-Eintauchen die Proben für die endgültige Austrocknung mit zwei 30-minütigen Änderungen in 100%Ethanol verarbeiten, um eine vollständige Sättigung zu gewährleisten, bevor die dehydrierten Proben in die Kammer des kritischen Punkttrocknungsgeräts gegeben werden. Versiegeln Sie die Kammer und öffnen Sie die Ventile, damit flüssiges Kohlendioxid einlüftet und das Ethanol entlüftet wird, bis flüssiges Kohlendioxid die Kammer vollständig füllt. Als nächstes versiegeln und langsam erhitzen, um einen kritischen Punkt zu erreichen, wenn der Kammerdruck 1.000 Pfund Druck pro Quadratzoll überschreitet, die Temperatur 31 Grad Celsius überschreitet und der Flüssigkeits- und Gasraum von Kohlendioxid im Gleichgewicht ist.
Dann abtropfen Sie langsam das Kohlendioxid aus der Kammer und der Probe als Gas, um auswirkungen der Oberflächenspannung auf die Probe zu vermeiden, und montieren, verfestigen und stellen Sie die Pilzproben wie gezeigt. Eine seitliche Rasterelektronenmikroskopie eines im Stadium 12 lackierten Schildkrötenembryons zeigt, wie sich die Kieferprominenz über die Unterkiefergrenze hinaus erstreckt und medial eine gut markierte Nasengrube begrenzt. Fünf Pharyngealbögen können ebenfalls beobachtet werden.
In einem Embryo der Stufe 15 sind neu gebildete Soden im hinteren Schwanzbereich des Embryos sichtbar, und die Vorderbinnenknospen zeigen kortischer als ventral. Ein klar definiertes Auswachsen eines Karagrückens kann auch entlang des gesamten Zwischen-Flankenbereichs des Embryos visualisiert werden. In Stufe 18 hat sich mit einem leicht umgedrehten unteren Schnabel mit einem Klemmhaken, der in die mittelste Kerbe des oberen Schnabels passt, eine kurze, schwach projizierte Schnauchgebildete gebildet.
Der Oberkiefer zeigt ein eingekerbtes Aussehen, und an der Spitze des Oberkiefers bildet sich ein winziger Eierzahn. Die ultrastrukturelle Analyse der Chrysemys picta Eierschale und Schalenmembran durch Rasterelektronenmikroskopie zeigt eine äußere Calcarinus-Eierschalenschicht, die fest an der inneren fadenförmigen Schalenmembran befestigt ist. Die Außenfläche der Eierschale besteht aus gut unterschiedenen mineralisierten Schaleneinheiten aus kugelförmigen Kugelknollen, die in Gruppen und zwischen benachbarten Schaleneinheiten angeordnet sind, mit einer Konzentration von kleinen abgerundeten Vertiefungen oder Poren unterschiedlicher Größe.
Gemeinsame Methoden können nicht für alle biologischen Proben verallgemeinert werden, um eine anständige Bildqualität mit SEM zu erreichen. Einzigartige Veränderungen, wie gezeigt, sind für einen bestimmten Gewebetyp unerlässlich. Die chemische und Lufttrocknungsmethode könnte auch für andere organische Proben verwendet werden, und die Kopplungs-Rutschkultur-Technik könnte für alle weichen, robusten mikrobiellen Kulturen verwendet werden.
