Name: preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
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This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

注意：それらを使用する前に、種々の試薬の物質安全データシート（MSDSの）を参照してください。試料調製の際に使用される化学物質のいくつかは、毒性発がん性、変異原性、および/または生殖毒性です。サンプルの処理中にヒュームフードの下で個人用保護具（手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）とワークを使用してください。ウルトラミクロトームで試料を区画することは鋭利な器具の使用を含む、およびこれらのツールを慎重に使用することは必須です。以下に説明する手順では、著者らは、試料は、細胞培養サンプルであると仮定する。プロトコルは、サンプルの種類、特に遠心分離工程に応じて変更される必要があり得ます。 緩衝剤およびそれらの混合物の調製<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa 2 HPO 4、および1.76 mMのKH 2 PO 4）を調製。 </li><li> 30％、50％、70％等を含有する溶液を調製しますサンプル脱水のためにPBS中hanol。徐々にエタノール濃度を増加させ、サンプルをインキュベートすることにより、試料の脱水を実行します。 </li><li> （ビスフェノールA-（エピクロルヒドリン）（20mL）中、ドデセニル無水コハク酸（9 mL）を、メチル-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸（11 ml）を混合することによりエポキシ樹脂を準備し、そして2,4,6-トリスジメチルアミノメチル）フェノール（0.7 mL）を、他の混合比は、樹脂の所望の硬度に応じて使用することができます。 </li><li>サンプル埋め込みエタノール中30％、50％、及び70％のエポキシ樹脂を含む溶液を準備します。徐々に樹脂の濃度を増加させて試料をインキュベートすることによって、樹脂の埋め込みを行います。 注：調製した溶液の体積が検討されているサンプルの種類によって異なります。以上の溶液は、細胞培養のためのより組織のために必要とされます。 </li></ol>サンプルの2.固定および着色<ol><li>遠心分離機5000×gで5分間、細胞培養。同じ条件を用いて、以下の遠心分離のすべてを実行します。</li><li>上清を捨て、4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドを含むPBS（1mL）にそれを再懸濁することにより細胞ペレットを修正。 30分（ 図1A）、室温で静置します。代わりに、一晩または週末の間、4℃で細胞を固定。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、完全に固定剤を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。 </li><li>室温で30分間、PBS中の1％のOsO 4（1 mL）でサンプルをポスト修正。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、完全のOsO 4取り除くためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。油中のOsO 4を無効化し 、廃棄します。 </li><li>造影剤としてPBS（1mL）中の2％酢酸ウラニルを追加し、室温（ 図1B）で30分間サンプルをインキュベートします。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、未結合のウラニル交流を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄etate;酢酸ウラニルは、放射性元素が含まれており、放射性廃棄物専用のビンで処分しなければなりません。 注：インキュベーション時間は、試料の大きさに応じて変更することができます。例えば、組織試料と厚い試料の固定および染色は、より長いインキュベーション時間を必要とします。より長いインキュベーション時間は、また、脱水および埋め込みステップのためのより良いかもしれません。酢酸ウラニルは、ガドリニウム塩を含む「ウラニルレス」溶液で置き換えることができます。 </li></ol> 3.サンプル・脱水<ol><li>遠心分離後、上清を捨て、30％エタノール（ 図1C）を含むPBS中で4°C（1 mL）中で30分間試料をインキュベートします。 </li><li>徐々に増加するエタノール濃度（50％、70％、および100％まで）溶液を用いて手順を繰り返し3.1。これらの脱水工程の間、サンプルの保存のために4℃で試料を維持します。 </li><li>遠心分離した後、supernatを破棄アリと純エタノール（1 mL）にペレットを再懸濁。 4℃で一晩インキュベートします。 </li></ol> 4.樹脂埋め込み<ol><li>遠心分離後、上清を破棄し、RT（ 図1D）で30分間30％のエポキシ樹脂（1 mL）でエタノール中でペレットを再懸濁します。 </li><li>徐々にエポキシ樹脂濃度（100％まで、50％、70％など）を増加させるの溶液を使用して手順を繰り返し4.1。 </li><li>遠心分離後、上清を破棄し、純粋なエポキシ樹脂（1 mL）中にペレットを再懸濁します。 RTで一晩インキュベートします。 DMP-30の硬化の存在は、樹脂の重合を誘発する可能性があります。この問題が発生した場合には、エポキシ樹脂の二つのバッチ、1とし、DMP-30のないものを準備します。 </li><li>遠心分離した後、純粋なエポキシ樹脂の200μLプラスチックカプセル内（硬化剤​​を含む）中にペレットを再懸濁。サンプルは、プラスチックカプセルの一番下にあるべきです。 </li></ol> 5.樹脂重合<ol><li>私48時間、60℃に設定したインキュベーター中でサンプルを含有するプラスチックカプセルをncubate。樹脂の他の種類は異なる設定で重合することがあります。 </li><li>インキュベーターからカプセルを外し、樹脂が重合していることを確認してください。硬い表面に押し付けた場合の樹脂は、ハードでなければなりません。 </li><li>試料を含む重合樹脂の上に（硬化剤を含む）、純粋なエポキシ樹脂を追加します。樹脂のこの余分な層は、それが簡単にサンプルをカットするようになります。 48時間60℃でカプセルをインキュベートします。 </li></ol> 6.サンプルセクショニング<ol><li>サンプルが上に向かっているように、試料ホルダ内の試料逆さまにマウントして、ウルトラミクロトームのトリミングブロックにそれを修正。しっかりウルトラミクロトームにトリミングブロックを確保するためのレバーをロックします。 </li><li>かみそりの刃または類似の鋭利な切断器具を使用して、重合樹脂からそれを分離するためにプラスチック製のカプセルを切り出します。サンプルが含まれているように、樹脂をカットピラミッドのおおまかな形状で樹脂中に編。全体プラスチックカプセルを削除する必要はありません。唯一の重合サンプルを覆っている部分を削除します。 </li><li>カプセルやトリミングブロックのオフ試料ホルダーを取り、ウルトラミクロトームの移動アームに取り付けます。 </li><li>ナイフブロックにトリミングナイフをインストールし、正確にピラミッドの顔をトリミング。双眼鏡の使用は、ピラミッドに最適な形状を与えることをお勧めします。ピラミッドより良い、より良いセクションになります。 </li><li>トリミングナイフを脱いで、0.5ミクロンよりも厚いセクションを切断するために使用することができ、組織学ナイフと交換してください。 </li><li>水の正確な量の組織学ナイフのキュベットを充填した後、試料の表面にナイフの刃先を持参し、ナイフはピラミッドに垂直にスライスするように、カプセルのピッチ角を調整するために双眼鏡を使用しています。 </li><li>希望に応じて切削速度を調整しますセクションの厚さが均一な切片を回収しました。 </li><li>水上セクションフロートをしようと、ループでそれを釣ります。 </li><li>ろ紙の上に配置された電子顕微鏡銅グリッドに向かってループを動かします。 注：グリッドは、その親水性を高めるために、以前に処理されている必要があります。これは、グリッドコーティングペンで行うことができます。 </li><li>ろ紙による水の吸収のために、セクションはグリッドに固執しましょう。電子顕微鏡に挿入する前に数分間、それが乾燥してみましょう。 </li></ol>スルー焦点チルトシリーズの7デザイン<ol><li>一定の焦点間隔でスルー焦点画像を収集します。 注：スルー焦点チルトシリーズは、チルトシリーズの各傾斜角度で収集されたスルー焦点イメージのセットで構成されています。全焦点振幅は、サンプル全体の厚さをカバーするのに十分であるべきです。 </li><li>フォーカス間隔の値を決定します。間隔がdに等しい場合epth-の視野、焦点のサンプル全体を集めます。この設定は、可能な限り最高のサンプリングを表します。間隔は、被写界深度より大きい場合、試料の一部は、サンプルの一部が焦点に収集されないことを意味し、焦点で取得されません。 </li><li>被写界深度電子の波長からの電子ビームと電子ビームの収束半角を計算します。電子の波長を直接加速電圧に連結されているのに対し、電子顕微鏡の製造業者によって提供収束半角を使用するか、または既知の試料16の回折パターンから実験的に決定します。電子は、波長λで加速するので被写界深度（DOF）を決定するために次の式を使用し、電子顕微鏡でαの収束半角でサンプルをヒット： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li>設計全体の焦点振幅がその最大見かけの厚さでサンプルをカバーするように、焦点シリーズ（ すなわち、その最高の傾きで）。 注：0.75ミクロンの厚さの試料を、70°の傾斜で2.19ミクロンの見かけの厚さを持つことになりますので、フォーカス振幅は2.19ミクロン以上でなければなりません。上記で決定したフォーカス間隔が50nmに等しい場合、このサンプルでは、​​それはその最大見かけの厚さでサンプルをカバーする44の画像（2.19ミクロン/ 50 nm）を必要とします。全焦点振幅焦点ステップの数を乗じた焦点間隔の値に等しいです。最高の傾き（θ）では、サンプル見かけの厚さは、次のように定義されます。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8.サンプル画像注：これは、STEMモードでの電子顕微鏡を設定する方法を説明するために、このプロトコルの範囲を超えています。この情報のほとんどはI見つけることができますn個のリファレンスマニュアルは、電子顕微鏡の製造元が提供します。ただし、次の点に注意してくださいⅰ）スポットサイズは、所望の倍率に応じて選択する必要があります。 ⅱ）ロンチグラムはよく整列させる必要があります。およびiii）BFモードでは、カメラの長さは、検出器の良好な照明を維持しつつ、非散乱電子を選択するように調整されなければなりません。電子顕微鏡銅グリッド上に堆積させた樹脂のセクションでは、収縮を防ぐために、画像取得の前に点灯している必要があります。樹脂の収縮と帯電効果は、画像取得の際に混乱する可能性があります。帯電効果が発生した場合、対物レンズの開口の使用は、サンプルの安定性を向上することがあります。しかし、STEMのセットアップの特定の場合には、対物絞りはHAADF撮影モードと互換性がない、と非常に小さい目的開口は、BFの撮影モードと互換性がありません。 <ol><li> （STEMで20,000前後）低倍率を使用して、サンプルを参照し、関心領域を探します。 </li><li>トンを調整サンプルを回転させながら、関心領域が離れてドリフトしないように、彼は高さ（Z軸）をユーセントリック。 </li><li>興味の対象が全体のチルト範囲全体にわたって表示されたままになりますことを確認します。 </li><li>スルー焦点チルトシリーズの間に取得された画像の実質的な数のため、自動収集ソフトウェアを使用しています。いずれかの商用ソリューションを使用するか、または希望する場合は、カスタムデータ収集ソフトウェアを設計します。ソフトウェアプログラムは、3次の手順を実行することが可能であることを確認します。 <ol><li>追跡し、標準的なチルトシリーズコレクション方式のように焦点を当てます。 </li><li>スルー焦点画像はサンプルのZ位置と重なっていることを確認してください。 </li><li>自動的に各傾斜角度におけるスルーフォーカル一連の画像を取得します。 </li></ol></li><li>ソフトウェアプログラムを介して焦点傾斜シリーズの主なパラメータ（ すなわち、焦点間隔の焦点ステップ、最小傾斜角、最大傾斜角、傾斜ステップ、および走査速度）を得ました。 </li><li>開始画像収集プロセスや仕上げにソフトウェアプログラムを待ちます。 </li></ol> 9.画像処理注：このプロトコルでは、スルーフォーカルチルト系列処理はImageJのプラグイン17を使用して実行されます。補足データ1は、アライメント工程（Turboreg）および3焦点値で設計スルー焦点チルトシリーズの合焦情報（フィールドの拡張深さ）をマージするためのImageJのマクロを示しています。 <ol><li>同じ傾斜角（ すなわち、スルー焦点画像）で収集した画像の位置を合わせます。イメージが同じで、フォーカスの情報を持っていないので、位置合わせのための同じ機能を抱いていません。 Turboreg 18、ImageJのプラグインを使用して（ すなわち、最初に最も近い焦点値で、ピラミッド型の階層を次の）近隣の画像2つずつ整列させることにより位置合わせを行います。 </li><li>一貫して、各傾斜角でスルー焦点画像の位置合わせを確認してください。目視検査を改善するために整列スルー焦点画像スタック。 注：スタックをブラウズ中にのみ焦点が合っているゾーンが移動する必要があります。次のステップは、異なる画像からピントが合っている情報の回復で構成されているので正確な位置合わせは、最も重要なことです。 </li><li>フィールド19、ImageJのプラグインの拡張深さを使用してフォーカスされている情報をマージします。これは、最終的に画像のスタックから単一の画像を生成します。いくつかの設定は、被写界深度の回復中に使用されるが、画像情報を保存するために、最高の設定を使用することができます。 注：傾斜シリーズは、現在のチルト角毎に単一の画像、スルー焦点画像から回収された合焦情報を含む各画像から構成されています。 </li><li>データを処理します。 注：データは現在、標準的なチルトシリーズに還元されているので、アライメント・復興のための標準ツールを使用することができます。このプロトコルでは、TomoJは私たちですデータのアライメントおよびデータ再構成20、21のためのエド。 TomoJを使用する方法についての詳細は、元の出版物22に記載されています。 </li><li>チルトシリーズのファインアライメントを実行します。 注：良い戦略を正確に画像間のシフトを追跡するための基準マーカーとしての金のビーズを使用することです。金ビーズをサンプルに添加することができない場合、極小値を使用することもできます。 </li><li>整列されたデータの3D再構成を実行します。いくつかのアルゴリズムは、利点と制限が各実空間またはフーリエ空間に再構成を行うために利用可能です。 </li><li>チルトシリーズの最終的な位置合わせが悪い場合は、最初の手順を最適化することにより、いくつかの改善を行います。最終的な3D再構成がぼやけたり変形していると思われる場合は、アライメントの手順を繰り返します。実際には、収集した焦点面のより多くの、より良いコントラストと3D再構成の詳細。 注：セveralソフトウェアプログラムを介して焦点チルト系列を処理するために使用することができます。しかし、このプロトコルで使用されるツールが選ばれたので、私たちの経験では、彼らは最高の行わ。 Turboreg 18は、フォーカスの勾配が存在したときに画像を整列させるという点で優れた性能を発揮しました。さらに詳しい情報は専用ウェブサイト23上で見つけることができます。他のツールは、可視ピクセルの変更が生じたのに対し、フィールドのプラグイン19の拡張深さは、異なる画像からの合焦情報を回復するという点で非常に好調に推移しました。詳細については、特にに関するスクリプトの書き込みは、この専用のウェブサイト24上で見つけることができます。 </li></ol>

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We have no conflict of interest to disclose.

この記事では、スルー焦点断層撮影STEMを使用して厚い生物学的サンプルに3D解析を実行するためのステップバイステップのガイドと一緒に、従来の試料調製プロトコルを提示します。生体試料の樹脂埋め込みが何十年26のために使用されており、試料の異なる種類に適合される代替のプロトコルは文献27を通して見ることができます。対照的に、スルーフォ...

1970年代初頭以来、断層撮影法は、広く、生物学的標本1、2、3の構造の特徴付けのために使用されてきた透過型電子顕微鏡（TEM）に近づきます。透過型電子断層撮影法の魅力は、細胞の構造および細胞小器官の超微細構造の巨大分子複合体およびタンパク質の構造に、ナノメートルスケールでの生物学的構造の広い範囲を研究するために使用することができるということでした。それにもかかわらず、透過型電子断層撮影法は、非常に厚い試料（0.5μm以下）を研究するために使用することができませんでした。実際、厚い標本は、低い信号対雑音比（SNR）の画像を生成し、あまりにも多くの散乱電子を生成します。さらに、断層撮影法は、試料の見かけの厚さが、傾斜角の増加と共に、傾斜片の画像のコレクションを含みます。非弾性散乱をフィルタリングすることができるにもかかわらずエネルギーフィルタを用いて、高SNR画像のために必要な電子の臨界量はほとんどTEMに達しました。したがって、厚い生体試料は、わずか4を区画用いて研究されてきました。 それらが切断されたときにいくつかが低下する可能性があり、他はその複雑さを理解するために、その全体で検討する必要がありますいくつかのサンプルをスライスすることはできません。別のアプローチは、走査モード5、6、7、8のTEMを使用することです。透過電子顕微鏡（STEM）の走査において、電子の光路は、従来のTEMと異なります。弾性散乱ものは暗視野（DF）検出器を光軸からある角度で収集することができ、一方、散乱せずに試料を通過する電子は、明視野（BF）検出器9との光軸上に集めることができます。STEMの他の利点は、集束電子ビームは、画像のピクセルごとの収集を可能にする、試料の表面で走査されることです。サンプル10を通過しながら電子ビームを広げても、この特定の収集方式は、従来のTEMより非弾性散乱電子の影響を受けにくいです。また、これにより、TEMで発生する可能性が色収差を回避STEMにはレンズ後の試料​​は、ありません。 BF検出器は、主に非散乱電子を検出するようにカメラの長さを調整することができます。厚い試料を研究するためにDF検出器を使用することであるため、不正確な画像を生成する多重散乱、お勧めできません。代わりに、BF検出器11を使用することができます。 STEMは、高SNR画像を生成することができるが、それは厚いから回収することができる詳細な情報の量を減少させる、ためTEMに比べて比較的高いビーム収束比較的低い被写界深度を有します標本。フォーカスされている情報は、わずか数ナノメートルの焦点面に由来するように、輻輳角は30ミリラジアンと高くすることができ、収差補正STEM顕微鏡の場合には、被写界深度が十分に低くすることができ。パラレルモードでは、電子ビームを設定する分解能12の犠牲に被写界深度電子ビームを高めます。しかし、この設定は常に可能ではありません。 それは収束電子ビームを使用する必要があるたびに厚い試料を研究するとき、人は被写界深度電子ビームを高める技術を使用しなければなりません。最近の研究では、合焦情報13、14の最大量を回収するために、試料の様々な焦点面における複数の画像の取得を報告しています。二つの研究は、異なる焦点面からの情報を処理するためのさまざまな方法について説明します。ホーブデンら。様々な焦点面で収集した画像は、フーリエ空間で組み合わせ、最終再構成13を変換次元逆フーリエ変換から直接得ました。対照的に、ダーメンら。実空間内の様々な焦点面14から3Dボリュームを再構成する収束ビーム再構成エンジンを開発しました。私たちの研究室でも厚い生物学的標本を画像化するための方法を開発しました。当社の戦略は、我々は、様々な焦点面にフォーカスされている情報をマージして平行ビームプロジェクター15を用いて、実空間での最終3Dボリュームを再構築し、その中に上記の二つの方法は異なっていました。私たちの目的は、簡単に任意の電子顕微鏡研究室で行うことができる方法を開発することでした。この目的のために、我々は、従来の断層撮影実験の時間枠に相当する時間の限られた量で焦点画像を収集することを目的としました。また、提案手法のC整列および再構築ソフトウェアの異なるタイプで使用するために適合されウルド。 2015年15から私たちの出版物の文脈において、我々は、被写界深度の回復を可視化し、特徴づけるために望んでいたので、私たちは25 mradでの大規模な収束半角を使用しました。ここでは、2015年15で私たちの研究室で開発された方法に従って、STEMにスルー焦点イメージングを実行するためのステップバイステップのプロトコルを提示し、我々は2015年からのデータが処理された方法を提示します。この方法は、厚さ（750 nm）の生物学的サンプル中の複数の焦点面からの合焦情報を回復し、高品質の3D再構成を可能にします。該当する場合、他のグループによって使用される方法に対するこの方法論の違いも提示されています。

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxyde</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Capsule</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Triming and Histo knives</td><td>LFG Distribution</td><td>Diatome diamond knives</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy copper grid</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Grid Coating Pen</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Holder</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

我々の研究では、電子が電界放出銃の透過型電子顕微鏡で200 kVのに加速しました。画像は、20マイクロ秒の滞留時間を用いてSTEMのBFモードで収集しました。スルー焦点チルトシリーズのデザインに関しては、我々は750nmの厚さの生物学的サンプルであっても、電子ビームの被写界深度があったものののみの超微細構造研究のために満足のいく結果が得られた150nmでのフ?...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K ビュー.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

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Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of the woodboring beetle, Chlorophorus caragana Xie &#38; Wang (2012), for both types of electron microscopy. The scanning electron microscopy (SEM) sample preparation protocol was based on sample chemical fixation, dehydration in a series of ethanol baths, drying, and sputter-coating. By adding Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) to the fixative and the wash solution, the insect body surface of woodboring beetle was washed more cleanly in SEM. This study&#39;s transmission electron microscopy (TEM) sample preparation involved a series of steps including fixation, ethanol dehydration, embedding in resin, positioning using fluorescence microscopy, sectioning, and staining. Fixative with Tween 20 enabled penetrate the insect body wall of woodboring beetle more easily than it would had been without Tween 20, and subsequently better fixed tissues and organs in the body, thus yielded clear transmission electron microscope observations of insect sensilla ultrastructures. The next step of this preparation was determining the positions of insect sensilla in the sample embedded in the resin block by using fluorescence microscopy to increase the precision of target sensilla positioning. This improved slicing accuracy.

In order to observe ultrastructure of insect sensilla, scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM, respectively) sample preparation protocol were presented in the study. Tween 20 was added into the fixative to avoid sample deformation in SEM. Fluorescence microscopy was helpful for improving slicing accuracy in TEM.

木管化カブトムシの付属物の走査型および透過型電子顕微鏡の試料調製方法

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...

環境学

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

工学

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

生物工学

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

生物学

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

極低温電子断層撮影の最適化戦略

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.