Durch die Synchronisierung von Zellen in der ersten Phase und die anschließende Erschöpfung des Zielproteins in einem bestimmten Stadium kann diese Methode vorübergehend unterschiedliche Funktionen bestimmter Proteine identifizieren. Der bedingte Abbau von Proteinen in bestimmten Stadien der Myose verhindert die Restwirkungen, die eine traditionelle myotische Mutante in späteren Stadien haben kann. Diese Methode könnte verwendet werden, um knospende Hefemitose und andere Organismen zu untersuchen, die keinen Kernhüllenabbau erfahren.
Darüber hinaus kann diese Methode in anderen Organismen verwendet werden, um Zellzyklusereignisse vor dem Zusammenbruch der Kernhülle zu untersuchen. Machen Sie zunächst ein Agar-Pad, mit dem eine Monoschicht von Zellen für die Bildgebung erstellt wird. Schneiden Sie die Kappe und das untere Drittel eines 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens ab und entsorgen Sie es, um einen Zylinder zu erstellen, der als Form für das Agarkissen dient.
Stellen Sie den geschnittenen Mikrozentrifugenzylinder auf einen sauberen Glasobjektträger, wobei die Oberseite des Röhrchens auf dem Kopf steht und auf dem Objektträger sitzt. Stellen Sie sechs Milliliter einer 5%igen Agarlösung in einem 50-Milliliter-Becherglas her. Schneiden Sie die Spitze der Pipette ab, um eine größere Öffnung zu erhalten, und pipettieren Sie etwa 500 Mikroliter geschmolzenes Agar in das Mikrozentrifugenröhrchen.
Lassen Sie es bei Raumtemperatur stehen, bis der Agar erstarrt. Zur Herstellung von Hefezellen werden 200 Mikroliter der Sporulationskultur bei 800 g zwei Minuten lang in Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen heruntergeschleudert. 180 Mikroliter des Überstands verwerfen.
Resuspendieren Sie das Pellet im verbleibenden Überstand, indem Sie das Röhrchen schwenken und schnippen. Sechs Mikroliter der konzentrierten Zellen werden an Ort und Stelle mit ConA auf das Deckglas in der Mitte der Kammer pipettiert. Halten Sie den Zylinder mit dem Agarkissen fest und schieben Sie ihn vorsichtig vom Glasobjektträger.
Stellen Sie sicher, dass der Agar unten völlig flach ist, und üben Sie mit der Unterseite der Pipettenspitze einen leichten Druck auf die Mikrozentrifugenform aus, so dass das Agarkissen leicht über den Rand des Röhrchens gedrückt wird. Als nächstes drehen Sie die Form so um, dass das Agarkissen nach unten zur Kammer zeigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Agarkissen vorsichtig auf die Zellen zu legen, und die Pipettenspitze, um das Agarpad vorsichtig 10 bis 20 Mal um die Kammer zu schieben, um eine Monoschicht von Zellen auf dem Deckglas zu erzeugen.
Bewahren Sie das Agarkissen 12 bis 15 Minuten in der Kammer auf. Als nächstes werden zwei Milliliter Sporenkultur in zwei Mikrozentrifugenröhrchen überführt und zwei Minuten lang bei 15.700 g gedreht. Nachdem Sie den Überstand in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführt haben, drehen Sie ihn erneut unter dem gleichen Zustand und sammeln Sie den Überstand, um die Mikrozentrifugenröhrchen zu reinigen.
Geben Sie zwei Milliliter des Überstands tropfenweise in die Kammer mit dem Agarkissen. Sobald die Flüssigkeit die Oberseite der Kammer erreicht hat, wird das Agarkissen höchstwahrscheinlich schwimmen. Entfernen Sie das Agarkissen vorsichtig mit einer Pinzette und entsorgen Sie es.
Legen Sie ein 24 x 50 Millimeter großes Deckglas auf die Oberseite der Kammer, um eine Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern. Um den Film auf dem Mikroskop einzurichten, stecken Sie das Deckglas in den Diahalter. Kleben Sie die Formmasse an die Seite des Deckglases, um sie sicher im Diahalter zu verstauen.
Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware. Verwenden Sie grobe und feine Einstellknöpfe, um die Zellen mit DIC oder Hellfeld zu fokussieren. Klicken Sie im Hauptmenü der Bilderfassungssoftware auf Datei, wählen Sie Erfassen, und es werden vier Fenster angezeigt.
Klicken Sie im Fenster Resolve 3D auf das Erlenmeyerkolben-Symbol. Dadurch wird ein Fenster mit dem Titel "Design Run Experiment" geöffnet, das die Steuerelemente zum Einrichten eines Experiments zum Einrichten eines Zeitrafferfilms enthält. Navigieren Sie auf der Registerkarte Entwurf zur Registerkarte Abschnitte.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Z-Schnitt, und stellen Sie den optischen Querschnittsabstand auf einen Mikrometer und die Anzahl der optischen Schnitte auf fünf ein. Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte Kanäle auf das Plus-Symbol und wählen Sie den entsprechenden Kanal aus. Wählen Sie dann das Kästchen neben Referenzbild aus und legen Sie die Z-Position im Dropdown-Menü auf die Mitte der Probe fest.
Wählen Sie einen Wert für Transmission und Belichtungszeit aus dem Dropdown-Menü aus. Aktivieren Sie auf der Registerkarte Zeitraffer das Kontrollkästchen neben Zeitraffer und geben Sie Werte für Minuten und Stunden ein, um das Zeitintervall der Bildaufnahme anzugeben. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben "Fokus mit ultimativem Fokus beibehalten", um Bühnendrifts während des Films zu vermeiden.
Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Punkte" das Kontrollkästchen neben "Punkteliste besuchen". Klicken Sie im Hauptmenü auf Ansicht und wählen Sie Punktliste. Bewegen Sie die Bühne in einen Bereich der Kammer, der eine Monoschicht von Zellen zeigt.
Klicken Sie im Fenster Punktliste auf Punkt markieren. Verschieben Sie die Bühne, um 25 bis 30 Punkte ohne Überlappung auszuwählen, um eine Überbelichtung der Zellen zu vermeiden, und bilden Sie jedes Feld während jedes Zeitverlaufs ab. Wählen Sie im Fenster "Punktliste" die Option "Alle kalibrieren", um den endgültigen Fokus für jeden Punkt festzulegen.
Speichern Sie die Datei auf der Registerkarte Ausführen am entsprechenden Ziel auf dem Computer. Wählen Sie im Fenster "Test ausführen" die Schaltfläche "Abspielen" aus, um den Film zu starten. Öffnen Sie die Fidschi-Software.
Öffnen Sie die Kanäle DIC und mCherry. Um eine einzelne Projektion mit maximaler Intensität des mCherry-Kanals zu erhalten, klicken Sie auf Bild, gefolgt von Stacks und Z-Projekt und wählen Sie Maximale Intensität aus dem Dropdown-Menü. Um die DIC- und mCherry-Kanäle in einem Bild zusammenzuführen, klicken Sie auf Bild, Farbe und wählen Sie Kanäle zusammenführen.
Folgen Sie einer einzelnen Zelle durch Meiose. Nach Abschluss der Meiose II notieren Sie die Anzahl der DNA-Massen. In Wildtyp-Zellen mit dem Ankerhintergrund gibt es typischerweise vier DNA-Massen am Ende der Meiose II, die die vier Produkte der Meiose darstellen.
In einem kleinen Teil der Zellen sind nach Meiose II nur drei Massen sichtbar.Wenn Ctf19-FRB zum Zeitpunkt der Freisetzung von Prophase I verankert ist, zeigen etwa 47% der Zellen nach Abschluss der Meiose mehr als vier DNA-Massen, was auf einen Defekt in der Befestigung von Kinetochoren und Mikrotubuli hindeutet. Mit der Verankerung von Ctf19-FRB, entweder nach Kinetochore-Assemblierung, aber vor Meiose I oder nach Meiose II, zeigen etwa 16% der Zellen zusätzliche DNA-Massen. Einer der wichtigsten Teile dieses Protokolls besteht darin, den Überstand tropfenweise in Ihre Kammer zu geben, um eine Unterbrechung Ihrer Monoschicht zu vermeiden.
Notieren Sie sich außerdem die Zeit, die für die Vorbereitung der Bildgebung erforderlich ist, um sie in Ihrer Analyse zu berücksichtigen. Durch die Veränderung von fluoreszierend gepackten Proteinen kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Fragen nach der Dauer des Zellzyklus, der Chromosomentrennung, der Proteinhäufigkeit und der Proteinlokalisation zu beantworten.
