We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

Alle experimentellen Verfahren wurden von der institutionellen Tierausschuss am Cincinnati Children Research Foundation genehmigt. 4 Monate - Für diese Studie wurden hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark von C57Bl / 6 Inzuchtmäusen im Alter von 2 isoliert. CD34 - - Gating - Strategie Zelle mittels FACS nach der Färbung von BM mit unterschiedlichen Oberflächenträgern einschließlich Lineage Sortierung, c-Kit, Sca-1, Flt3 und CD34 wurde für die Reinigung von HSC auf Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 Basis verwendet als Standardprotokoll beschrieben vor 8. ACHTUNG: Mehrere hochgiftige Chemikalien werden bei diesem Verfahren verwendet. Diese sind giftig beim Einatmen und Hautkontakt möglich. Bitte tragen Sie Handschuhe und Schutzkleidung. Die Arbeit in Dunstabzug, während mit diesen Chemikalien arbeiten. 1. Zellen, Fixierung, Färbung und Pre-Einbettung <ol><li> Sort 10.000 hämatopoetische Stammzellen (mit Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - Gating - Strategie; LT-HSC Population) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 600 ul Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 10% fötalem Rinderserum FACS verwendet. </li><li> Spin down sortierten HSZ bei 1.000 × g für 10 min in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eine Zentrifuge mit ausklappbarem Eimer verwenden. Entfernen Sie Medium durch leichtes Ansaugen und lassen 200 &amp; mgr; l Medium in den Rohren bei jedem Schritt. In diesem Stadium bleibt das Zellpellet in dem Röhrchen sichtbar. </li><li> Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 0,2 ml 2x Fixierungslösung bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde 1,9. <ol><li> Machen Sie die Fixierungslösung vor dem Gebrauch frisch. Bei 1x wird die Lösung von 3% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer besteht. </li></ol></li><li> Zentrifuge die Zellen bei 1.000 xg für 10 min bei 30 ° C eine Zentrifuge mit ausklappbaren buckets verwenden. </li><li> Wasche die Zellen mit 600 ul 0,1 M Cacodylatpufferunter Verwendung von Zentrifugation und 200 &amp; mgr; l Puffer in der Röhre nach dem Zentrifugieren verlassen. </li><li> Beflecken die fixierten Zellen durch Zugabe von 200 ul 2 mg / ml Lösung von Evans Blue in Cacodylatpuffer und Inkubation für 20 min bei RT. Die Zellen werden blau gefärbt. </li><li> Waschen Zellen 3-mal mit 600 ul 0,1 M Cacodylatpuffer mittels Zentrifugation und sind 200 &amp; mgr; l Puffer in dem Rohr jedesmal. </li><li> Wieder die Zellen in 200 &amp; mgr; l Puffer und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 0,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min eine Tischzentrifuge verwenden. Entfernen Puffer sanft, ohne die nun sichtbare winzige Zellpellet zu stören, und lassen Sie 50 ul Puffer in die Röhre. </li><li> Mit 200 mg niedrigschmelzenden Agarose zu 5 ml von 0,1 M Cacodylatpuffer in der 15-ml-Röhrchen für eine 4% Agarose-Lösung. Schmelzen Sie die Agarose durch die Übertragung der Röhre zu kochendem Wasser in einem 100 ml-Glasflasche und halten lauwarm bis zur Verwendung. </li><li> Nach Zugabe von 200 ul 4% niedrig schmelzender Agarose in 0,1 M cacodyla gelöstTE-Puffer zu der Zellsuspension in 0,5 ml-Röhrchen und sofort bei 1.000 xg für 10 min bei 30 ° C zentrifugieren einer Tischzentrifuge verwendet wird. </li><li> Nach der Bestätigung, dass an Boden der 0,5 ml-Röhrchen pelletierten Zellen in das halbfeste Agarose nach der Zentrifugation übertragen sofort das Rohr auf 4 ° C oder Eis für 20 min, um die Agarose zu verfestigen. Dieser Schritt ist sehr kritisch, da eine kleine sichtbare Zellpellet in diesem Schritt resultiert in einem guten Cluster von Zellen, die unter dem Elektronenmikroskop. </li><li> Sorgfältig übertragen die verfestigte Agarose das Zellpellet aus dem Röhrchen auf einen 35 mm Kunststoff - Petrischale mit Puffer unter Verwendung einer 27 G - Nadel 3,10 enthält. </li><li> Schneiden Sie die erstarrte Agarose enthält das Zellpellet in einem Stück von etwa 1 bis 2 mm mit einem Skalpell. Übertragen Sie die Agarose-Stück des Zellpellets in ein neues 1,5-ml-Röhrchen enthält. </li><li> Waschen Sie 2 - 3 mal 600 ul 0,1 M Cacodylatpuffer Verwendung durch Hinzufügen und Entfernen von Puffer Pipette ohne Zentrifugation. Verwenden Sie diese Agarose-Stück des Zellpellets für den nächsten Schritt enthält. Bei diesem Schritt kann die Probe über Nacht bei 4 ° C gelagert werden, bevor zum nächsten Schritt bewegt wird. </li></ol> 2. Osmification, Dehydration, Embedding <ol><li> Entfernen Sie den Cacodylatpuffer aus dem 1,5-ml-Röhrchen mit dem Zellpellet Agarose enthält, mit einer Pipette. 1,0 ml 1% Osmiumtetroxid (OsO 4) Lösung in einem Abzug, und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Waschen dreimal mit 600 ul 0,1 M Cacodylatpuffer und übertragen Sie die Probe auf eine 20-ml-Glas Szintillationsphiole mit einer Kappe. </li><li> Verarbeiten Sie die Probe für die Entwässerung, Infiltration und Einbettung in Harz (zB LX-112) mit serieller Veränderungen der folgenden Lösungen in einer 6 - Well - Platte. Bewegen Sie die Zell-Pellet Agarose Stück mit einer Pinzette. <ol><li> Eintauchen der Probe in 25% Ethanol bei RT für 15 min. </li><li> Eintauchen der Probe in 50% Ethanol bei RT für 15 min. </li><li> Tauchen Sie die Probe in 75%Ethanol bei RT für 15 min. </li><li> Eintauchen der Probe in 95% Ethanol bei RT für 15 min. </li><li> Tauchen Sie die Probe in 100% Ethanol bei RT für 15 min, zweimal. </li><li> Tauchen Sie die Probe in Ethanol: Harz (3: 1) bei RT für 30 min. </li><li> Tauchen Sie die Probe in Ethanol: Harz (1: 1) bei RT für 30 min. </li><li> Tauchen Sie die Probe in Ethanol: Harz (1: 3) bei RT für 30 min. </li><li> Tauchen Sie die Probe in Reinharz bei RT für 60 min, zweimal. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Probe auf den Boden des Pyramidenspitze förmigen Gummiformzange vorsichtig und fügen Sie mehr reines Harz auf der Oberseite der Probe unter Verwendung der Form zu füllen. Inkubieren der Probe bei 60 ° C für 72 Stunden für die Harz Polymerisation. </li><li> Entfernen Sie die polymerisierte Harz Pyramide aus den Formen durch die Gummiform verdrehen. Eine kleine schwarze Cluster von Zellen sollten in dem polymerisierten Harz Pyramide sichtbar sein, wie zuvor beschrieben 7. Bringen Sie das polymerisierte Harz Pyramide auf dem Montagezylinder mit Cyanacrylat. </li></ol><ol><li> Schneiden Sie die Pyramide Block mit einer Rasierklinge und einem Diamantmesser nach den Block auf einem ultra-Mikrotom Montage. Machen Sie einen kurzen, breiten Trapezform mit der Oberseite und der Unterseite des Blocks parallel zueinander und mit gleichmäßig angewinkelt Seiten. Diese Form der Pyramide hilft für Serienschnitt. </li><li> Ferner schneiden Sie den Block um das Zellpellet mit dem Diamantmesser und die Kunststoff-Teile um das Zellpellet Agarose-Stück zu entfernen. </li><li> Cut 1 &amp; mgr; m Abschnitte ein ultra-Mikrotom. Verschieben Sie die 1 &amp; mgr; m Abschnitte aus dem Wasser Boot auf einem Glasobjektträger mit der Wimper Werkzeug und eine Metallschlaufe Werkzeug wie zuvor 7 berichtet. Transferabschnitte auf Objektträger und Transfer Folien der Heizplatte (37 ° C) zum Trocknen. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Toluidinblau-Lösung zu den Abschnitten eine Spritze mit 0,22 um-Filter ausgestattet ist und für 3 min inkubiert. Spülen Sie die Folien mit destilliertem Wasser und let die Abschnitte trocknen. Überprüfung mit einem Lichtmikroskop die Position der Zellen zu identifizieren. </li><li> Schneiden Sie ultra-dünne Schnitte (70-100 nm) mit einem Diamantmesser. Bewegen Sie 2 - 3 Abschnitte auf 200-Maschengitter aus dem Wasser Boot auf eine Glaspetrischale mit einem Wimpern Werkzeug. </li><li> Übertragen Sie die Glaspetrischale Gitter mit Abschnitten auf einer heißen Platte bei 30 ° C enthält Abschnitte zum Trocknen für 30 min. </li><li> Stain die Gitter mit Tropfen von 1% Uranylacetat bei RT für 10 min und dann spülen in destilliertem Wasser 6 - 8 mal. Stain mit Reynolds Bleizitrat bei RT für 5 min und spülen Sie in destilliertem Wasser 6 - 8 mal. Übertragung der Glaspetrischale die Gitter auf einer heißen Platte bei 37 ° C enthält Abschnitte zu trocknen. </li><li> Analysieren die Abschnitte mit einem Elektronenmikroskop bei 80 kV 7. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Verfahren ermöglicht die TEM-Analyse auf niedrigen Zellzahlen, die von Evans-Blau-Färbung mit und Einbetten von Agarose eine winzige Zellpellet während der Entwässerung, Harz Einbetten und Schneiden Prozesse zu lokalisieren. Wichtig ist, behält er Zellcluster zusammen und bewahrt die Zellultrastruktur, die mehrere Zellen für die Quantifizierung der Daten zu prüfen, wünschenswert ist. In TEM-Untersuchungen wird ein Zellpellet Millionen von Zellen enthalten, oft für eine effizi...

Ultra-strukturellen und Unter Organell Details der Zellen wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) -Studien aus Geweben oder Zellpellets 1,2 hauptsächlich offenbart. Feste Gewebeteile können leicht für die Elektronenmikroskopie-Studien genutzt werden. Allerdings analysiert TEM 1,3 auf Zellen in Suspension bleiben herausfordernd und erfordern hohe Zellzahlen, dh Millionen von Zellen. Wegen dieses ultra-Strukturanalysen von seltenen Zellpopulationen in Suspension, beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), sind nicht leicht zu beurteilen. Mehrere Versuche für die TEM-Analyse von knapp Proben Cytospin oder einschichtigen Ansätze scheitern erhebliche quantitative Daten aus der begrenzten Anzahl von Zellen zu erhalten. Somit begrenzt das Erfordernis einer hohen Zellzahl die Verwendung dieses leistungsstarken Werkzeug, um die subzelluläre ultrastrukturelle Details von seltenen Zellpopulationen zu verstehen. Eine Haupteinschränkung für die TEM-Untersuchungen mit einer begrenzten Anzahl von Zells in Suspension ist die Lokalisierung der Zellen für die Verarbeitung und damit TEM-Untersuchungen von begrenzten Zellen mit besonders kleinen Abmessungen bleiben schwierig. Mehrere alternative Ansätze gewählt wurden, um diese Beschränkung zu begegnen: die BSA / Bisacrylamid (BSA-BA) vermittelte Polymerisation von Zellsuspension, die Färbung der Zellen mit einem Farbstoff, um sie sichtbar auf einem dünnen Filmträger einschließlich Deckgläser, und TEM - Analysen von Cytospin Vorbereitungen 4-6. Es wurde jedoch sehr begrenzten Erfolg erzielt, da nur sehr wenige Zellen in den Abschnitten nach der ultra-Schnitte gefunden wurden. Die zentrale Herausforderung spärliche Zellen zu identifizieren, bestehen bleibt, da die Zellschicht meist unsichtbar in dem erstarrten Gel bleibt für das Schneiden. Ferner können Cytospin Herstellung von Zellen, die zelluläre Organisation aufgrund Zellausbreitung und die Zerbrechlichkeit der Zellstruktur zu verändern. Daher rechtfertigen diese inhärenten Nachteile einen neuartigen Ansatz TEM-Untersuchungen von seltenen Zellpopulationen mit mehr ausführenKonsistenz. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine neue und alternative Probenvorbereitung für TEM - Untersuchungen von seltenen Zellpopulationen 7 beschrieben. Hier berichten wir über eine effiziente Probenvorbereitung Protokoll zur Durchführung TEM von knapp biologischen Proben mit konsistenten qualitative und quantitative Ergebnisse. Evans - Blau - Färbung wurde nach der Fixierung durchgeführt , eine winzige Zellpellet aus geringen Anzahl Zellen, dh 10.000 Knochenmark hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen zu lokalisieren , die ansonsten unsichtbar blieben würde, und das Pellet wurde in Agarose vor der Dehydratisierung und Harzeinbettungsverfahren eingebettet. Diese Methode Clustern Zellen zusammen und ermöglicht die effiziente Analyse der Ultrastruktur und subzellulären Organisation von hämatopoetischen Stammzellen (identifiziert als Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC), einer seltenen 0,2 bis 0,5% Zellpopulation im Knochenmark. Diese experimentelle Prokoll kann nützlich sein, ultra-Strukturuntersuchungen durchführen und quantitative Ergebnisse auf viele seltene, aber sehr wichtige Populationen erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">15713</td>
			<td style="width:440px;">CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td>16350</td>
			<td>CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Cacodyladate buffer&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">12300</td>
			<td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4&#176;C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evans Blue&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">E-2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:113px;">A-5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Osmium tetraoxide&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">19130</td>
			<td>1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LX-112 Embedding Kits (LADD&#174;)</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21340</td>
			<td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NMA (Nadic methyl anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21310</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Uranyl acetate (EM Stain I)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">8072820</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ATCC</td>
			<td style="width:113px;">30-2005</td>
			<td>composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramid tip mold&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cylinders</td>
			<td style="width:216px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-microtome&#160;</td>
			<td style="width:216px;">(Leica EM UC7)</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">200 mesh grids (nikil)</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">G-200 Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi model H-7650&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Image capture engine software</td>
			<td>AMT-600&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">72588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials&#160;</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>03-337-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash tool</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Loop tool&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) stellt Details der zellulären Organisation und Ultrastruktur. Jedoch TEM-Analyse von seltenen Zellpopulationen, insbesondere Zellen in Suspension, wie beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), begrenzt bleibt aufgrund des Erfordernisses einer hohen Zellzahl während der Probenvorbereitung. Es gibt ein paar Cytospin oder einschichtigen Ansätze für die TEM-Analyse von seltenen Proben, aber diese Ansätze nicht signifikante quantitative Daten von der begrenzten Anzahl von Zellen zu erhalten. Hier ist eine alternative und neuartige Ansatz für die Probenvorbereitung in TEM-Untersuchungen wird für seltene Zellpopulationen beschrieben, die quantitative Analyse ermöglicht. Eine relativ niedrige Anzahl von Zellen, dh 10.000 HSCs wurde für die TEM - Analyse im Vergleich zu den Millionen von Zellen typischerweise für TEM - Untersuchungen erfolgreich eingesetzt. Insbesondere wurde Evans-Blau-Färbung nach paraformaldehyd Glutaraldehyd (PFA-GA) Fixierung ausgeführt, um die winzige Zelle pel zu visualisierenlassen, die in Agarose erleichtert das Einbetten. Cluster von zahlreichen Zellen wurden in ultradünnen Abschnitten beobachtet. Die Zellen hatten eine gut erhaltene Morphologie und die ultra-strukturellen Details der Golgi-Komplex und mehrere Mitochondrien waren sichtbar. Diese effiziente, einfache und reproduzierbare Protokoll ermöglicht die Probenvorbereitung von einer niedrigen Zellzahl und kann für die qualitative und quantitative TEM-Analyse auf seltenen Zellpopulationen aus begrenzten biologischen Proben verwendet werden.

Eine effiziente und konsistente Protokoll für die Probenvorbereitung TEM-Analyse durchzuführen, von geringen Anzahl von Zellen beschrieben. Post-Fixierung Färbung mit Evans - Blau und die Übertragung von Zellen auf einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen dazu beigetragen , die winzigen Zellpellet 7 visualisieren. Osmification mit Osmiumtetroxid in Agarose führte zu einer leichten Nachweis der dunklen Zellpellet während der Entwässerung und Einbettung. <p class="jove_...

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Biology

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Serie: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

Nichtentkalktem Knochen Vorbereitung für Histologie, Histomorphometrisch und Fluorochrom Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Forschung

Biologie

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...