Name: sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Bio &#38; Medical Technology Development Program des National Research Foundation (NRF) &#38; von der koreanischen Regierung finanziert (MSIP &#38; MOHW) (Nr. 2016M3A9B6904244). Wir danken auch Mitglieder des Medicinal-Bioconvergence-Forschungszentrum für die Reinigung der Exosom.

1. Block Vorbereitung, schneiden, färben und Imaging-von die Exosom
<ol>
	<li>Pellet-Exosomen von Kultur überstand HCT116 Zellen durch Zentrifugation bei 100.000 x g für 1,5 h23. Entfernen Sie die Kultur überstand und beheben sorgfältig gereinigten Exosom Pellet mit 1 mL 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M-Natrium-Cacodylate-Lösung (pH 7,0) für 1 h bei 4 ° c zu Lösen Sie für 0,1 M Natrium Cacodylate 4,28 g cacodylic Säure in 160 mL destilliertem Wasser (DW auf). Stellen Sie pH auf 7,4 mit 0,1 M HCl machen dann bis zu 200 mL mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel zu und spülen Sie die Pellets mit 1 mL 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie drei Mal mit jeder Änderung dauert 10 Minuten.</li>
	<li>Nach dem Beheben der Proben mit 1 mL 2 % Osmium ausgefällt für 1 h bei 4 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen dreimal mit 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer alle 10 Minuten.</li>
	<li>10 min mit einer Reihe von abgestuften Aceton inkubieren (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, beziehungsweise) auf den Shaker.</li>
	<li>Das Aceton zu entfernen und die Lösung von 3:1 Aceton: niedrige Viskosität einbetten Mischung für 30 min inkubieren. Die Exosom Kugel ist in der Röhre.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und 1:1 Aceton: niedrige Viskosität einbetten Mischung Medium hinzufügen, dann 30 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und 1:3 Aceton: niedrige Viskosität einbetten Mischung Medium hinzufügen, dann 30 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und 100 % niedrige Viskosität Mischung einbetten und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Einbetten der Probenmaterials in reinen niedrigviskos Einbettung Mischung mit dem Einbetten von Form und backen für 24 h bei 65 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Abschnitte mit 60 nm dicke durch eine Ultra-Mikrotom.</li>
	<li>Doppel-Fleck mit 2 % Uranyl Acetat für 20 min und führen Sie Citrat für 10 min. Fügen Sie für Reynolds Ader Lösung 1,33 g Blei Nitrat und 1,76 g Natriumcitrat auf insgesamt 50 mL destilliertem Wasser hinzu.</li>
	<li>Beobachten Sie das Raster unter Transmissions-Elektronenmikroskopie bei 80 kV.</li>
	<li>Klicken Sie auf "Acquire" und klicken Sie dann auf "Datei" und "Speichern unter" im CCD-Kamera-System unter dem Elektronenmikroskop bei 80 kV. Befolgen Sie die automatische Einstellungen für die Belichtungszeit.</li>
</ol>
(2) Immuno-Färbung des Abschnitte und Bildgebung (Abbildung 1)
<ol>
	<li>60 nm ultradünnen Abschnitte mit einem Ultra-Mikrotom schneiden und sammeln auf dem Nickel-Gitter.</li>
	<li>Inkubieren Sie Netze in 50 µL Tropfen 0,02 M Glycin für 10 min kostenlos Aldehyd-Gruppen zu stillen.</li>
	<li>Spülen Sie mit 100 μL der DW drei Mal jeweils für 10 min Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h in PBS mit 1 % BSA.</li>
	<li>Inkubieren Sie Netze in 50-100 µL Tropfen anti-KRS Antikörper24 (1: 100 mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA) 1 h (wenn nötig, diesen Schritt bei 4 ° C über Nacht durchgeführt werden soll.)</li>
	<li>Waschen Sie Gitter mit fünf separaten Tropfen (50 µL) von PBS mit 0,1 % BSA für 10 min.</li>
	<li>Übertragen Sie Gitter auf Tropfen 2Nd Antikörper für 1 h (Anti-Kaninchen, die IgG zu 10 nm gold Teilchen (1: 100) mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA konjugiert).</li>
	<li>Wash-Grids mit fünf trennen Tropfen (50 µL) PBS mit 0,1 % BSA jede 10 Minuten.</li>
	<li>Doppel-Fleck mit 2 % Uranyl Acetat für 20 min unter schlechten Lichtverhältnissen und Reynold es Blei Citrat für 10 min, beziehungsweise.</li>
	<li>Klicken Sie auf "Acquire" und klicken Sie dann auf "Datei" und "Speichern unter" im CCD-Kamera-System unter einem TEM bei 80 kV. Belichtungszeit folgte automatische Einstellungen.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Prozess der Probenvorbereitung und Immunostaining. (A) doppelte feste Exosom ist dehydriert und mit niedriger Viskosität Einbettung Mischung Harz infiltriert. (B) Harz einbetten. (C) ultra-dünnen Abschnitt mit Diamant Messer. (D) Setup zur Kennzeichnung von Immuno-Gold. Die Netze mit den ultradünnen Abschnitten sind auf flüssigen Tröpfchen auf ein Parafilm, die mit der feuchten Papiertuch gelegt wird. Jeder Abschnitt ist mit Tröpfchen von 50-100 µL Antikörper inkubiert, dann mit Puffer gewaschen. (E) verdoppeln Sie, Färbung mit Uranyl Acetat und führen Sie Citrat. Der Deckel ist mit Alu-Folie für Heavy-Metal Färbung bedeckt. (F) die Färbelösung wird durch Filterpapier entfernt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56482/56482fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
(3) negative Färbung
<ol>
	<li>Die dünne Formvar/Carbon Film beschichtet Kupfer 200 Mesh EM Gitter für 1 min durch Glühen Entlader Glimmentladung.</li>
	<li>Befestigen Sie gereinigte Exosomen mit 1 mL 2 % Paraformaldehyd (PFA) für 5 Minuten. Achtung: Paraformaldehyd Dämpfe sind giftig. Alle arbeiten sollten in einem gelüfteten Abzug durchgeführt werden.</li>
	<li>Laden Sie 5-7 µL Exosom Aussetzung Lösung in der Startaufstellung und 1 min inkubieren. Wenn die Konzentration der Exosom zu hoch ist, verdünnen Sie die Konzentration auf 1/2 - 1/5.</li>
	<li>Fleck sofort mit den ~ 20 Tropfen der gefilterten 1 % Uranyl Acetat (UA) Lösung auf die Oberfläche des Rasters EM mittels Spritze.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssige UA-Lösung in der Startaufstellung durch Kontaktaufnahme mit den Raster-Rand mit Filterpapier.</li>
	<li>Schnell spülen Sie das Gitter mit einem Tropfen Wasser. Dieser Schritt wird die überschüssige Färbelösung entfernen.</li>
	<li>Legen Sie das Raster auf den Tisch, indem Sie mit einer Pinzette halten, und decken Sie das Netz teilweise mit einer Kulturschale für 10 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Speichern Sie das Raster in einem EM-Gitterbox für zukünftige Beobachtung durch eine TEM bei 80 kV.</li>
</ol>
(4) die ganze Halterung für Immunostaining
<ol>
	<li>Glimmentladung die dünne Formvar/Carbon Folie beschichtet 200 Mesh Kupfer EM Grids für 30 s.</li>
	<li>Befestigen Sie gereinigte Exosomen mit 1 mL 2 % Paraformaldehyd (PFA) für 5 Minuten. Achtung: Paraformaldehyd Dämpfe sind giftig. Alle arbeiten sollten in einem gelüfteten Abzug durchgeführt werden.</li>
	<li>Laden Sie 5-7 µL feste Exosom Lösung in der Startaufstellung und für 5 min. Spülen mit 100 µL PBS inkubieren Sie dreimal jeweils für 10 min.</li>
	<li>Netze mit 50 µL 0,05 M Glycin für 10 min kostenlos Aldehyd-Gruppen zu stillen zu behandeln.</li>
	<li>Netze zu einem Rückgang von blockierenden Puffer (PBS mit 1 % BSA) für 30 min zu übertragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Netze mit 50-100 µL anti-PD-L1-Antikörper (1: 100 mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA) 1 h (wenn nötig, diesen Schritt bei 4 ° C über Nacht durchgeführt werden soll).</li>
	<li>Waschen Sie Raster mit fünf separaten Tropfen (50 µL) von PBS mit 0,1 % BSA für 10 min.</li>
	<li>Raster zu einem Rückgang von 2Nd Antikörper für 1 h zu übertragen.</li></ol>9 / 11 nm gold Partikel verdünnt 1: 100 mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA konjugierten Anti-Maus IgG.
	<li>Waschen Sie Raster mit fünf separaten Tropfen (50 µL) von PBS mit 0,1 % BSA für 10 min. Waschen Sie Raster mit zwei separaten Tropfen (50 µL), DW. Führen Sie negative Färbung mit 2 % Uranyl Acetat wie von 3,4 auf 3.8 beschrieben.</li>
	<li>Speichern Sie das Raster in einem EM-Gitterbox für zukünftige Beobachtung durch eine TEM bei 80 kV.</li>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Beobachtung der detaillierten Exosom Struktur und Kennzeichnung von seiner spezifischen Proteine. Negative Färbung galt als die beste Methode für Exosom imaging-17. Diese konventionelle Technik hat Exosomen becherförmigen Struktur gezeigt. Diese Becherform ist jedoch eine Form von Artefakt, das durch die Trocknung entstehen kann. Cryo-TEM Ergebnisse haben gezeigt, dass Exosomen eine perfekt kugelförmige Struktur in wässriger Lösung25<...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Lipid Bilayer Vesikel durch Zellen abgesondert, und ihre Größe schwankt zwischen 30 und 300 nm. EVs wurden erstmals im Jahr 1978 mit Beweisen aus Vesikeln von Patienten mit Morbus Hodgkin1gemeldet. Diese Vesikel wurden berichtet, dass 40 bis 120 Nanometer groß. Im Jahr 1980 wurde berichtet, dass das Gerinnungssystem und Thrombose, Bildung eines Blutgerinnsels in einem Blutgefäß im Krebs Patienten2EVs beteiligt sind. Nach 30 Jahren berichtet die EVs ein wichtiger Faktor zur Förderung Tumorinvasion, immun Flucht und Angiogenese3sein. Darüber hinaus wurden die Funktionen des EFD als Regulatoren in zellulären Interaktionen in den Bereichen von Entzündungen, Immunschwäche, neurologische Erkrankungen und Krebs4untersucht. Da EVs bestimmte Biomoleküle wie Proteine, mRNA und MicroRNA5enthalten, wurde ihre mögliche Anwendung in der Diagnostik und Therapie analysierten6,7. Elektrofahrzeuge sind eine Kategorie bestehend aus Subgruppen Exosomen, Prostasomes, Oncosomes, Dexosomes, Mikropartikel, Promininosomes, Argosomes und Exosom-wie Bläschen, abhängig von ihrer zellulären Herkunft und biologische Funktion3. Darüber hinaus können basierend auf ihrer Biogenese, diese EVs Microvesicles (Schuppen Microvesicles, 100-1000 nm) und Exosomen (30-300 nm)8,9unterteilt werden. Unter anderem wurde die Exosom als Zelle Kommunikator für Immune Antwort10, Krebs11,12, ansteckende Krankheit13berichtet.
Schnell wachsendes Interesse an den Exosomen als Biomarker für die Früherkennung und die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen mit molekularen Bildgebungsverfahren einhergehen müssen. Die unterschiedlichen Größen und Morphologien von Exosomen, je nach ihrer Herkunft und Funktion14können durch Mikroskopiertechniken mit hoher Auflösung, wie z. B. Elektronenmikroskopie unterschieden werden. Die meisten Exosomen waren negativ gefärbten Transmission Electron Microscopy (TEM)15,16,17visualisiert, und diese Ergebnisse wurden durch Immunolabeling eines spezifischen Proteins im ganzen Berg Vesikel bestätigt 18. mehrere Forschergruppen haben die Struktur durch Scanning Electron Microscopy, Atomic Force Microscopy19,20und Cryo-TEM21,22berichtet. Während diese Techniken fürs Studium Exosom nützen, sind sie jedoch nicht ausreichend für die Position von bestimmten Proteinen befindet sich im Inneren die Exosom zu beobachten. Daher haben wir ein Protokoll für imaging Exosomen eines spezifischen Proteins Kennzeichnung eingeführt. Wir blockieren Vorbereitung, ultradünnen schneiden und Immunostaining für die Feststellung des Proteins detaillierte Standort in die Exosom angewendet. Dies war im Vergleich zu negative Färbung und ganze Berg Immunostaining, die traditionell zur Charakterisierung von die Exosom dient.

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cacodylate&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide 1 g crystal</td><td>EMS</td><td>19100</td><td>Use only in fume hood</td></tr><tr><td>acetone</td><td>JUNSEI</td><td>1B2031</td><td></td></tr><tr><td>Spurr medium</td><td>TED PELLA</td><td>18108</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome</td><td>Leica</td><td>UCT</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Hazardous chemical</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscopy</td><td>Hitachi</td><td>H7600</td><td></td></tr><tr><td>nickel grid</td><td>EMS</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Copper grid</td><td>EMS</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>glycine</td><td>SIGMA</td><td>022K5404</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Aurion</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>1st Antibody</td><td></td><td></td><td>purification in manually&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>329710</td><td>Whole mount Immumogold</td></tr><tr><td>Purified Mouse IgG2b, &amp;kappa; Isotype Ctrl</td><td>BioLegend</td><td>401202</td><td>Whole mount Immumogold (Control)</td></tr><tr><td>2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle</td><td>sigma</td><td>G7652</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscopy</td><td>JEOL</td><td>JEM2200FS</td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>JEOL</td><td>JFC1100E</td><td></td></tr><tr><td>Carbon grid</td><td>EMS</td><td>121119</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)</td><td>EMS</td><td>FCF200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Formvar carbon coated&amp;nbsp; Nickel Grid (200 mesh)</td><td>EMS</td><td>FCF200-NI</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy

Exosomen Nanogrösse extrazelluläre Vesikel durch Körperflüssigkeiten ausgeschieden werden und sind dafür bekannt, die Eigenschaften der Zellen dar, die sie absondern. Den Inhalt und die Morphologie der sekretierten Vesikel reflektieren Zelle Verhalten oder physiologischer Zustand, zum Beispiel Zellwachstum, Migration, Spaltung und Tod. Die Exosomen Rolle kann hoch richten sich nach Größe und die Größe der Exosomen variiert zwischen 30 und 300 nm. Die am häufigsten verwendete Methode für die Exosom Bildgebung ist negative Färbung, während andere Ergebnisse auf Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie, Scanning Electron Microscopy und Atomic Force Microscopy basieren. Die typische Exosom Morphologie beurteilt durch negative Färbung ist eine Becherform, aber weitere Details sind noch nicht klar. Eine Exosom gut charakterisierten durch strukturelle Studie ist notwendig insbesondere im medizinischen und pharmazeutischen Bereich. Daher sollte Funktion-abhängige Morphologie durch Elektronenmikroskopie Techniken wie z. B. ein bestimmtes Protein in die detaillierte Struktur der Exosom Kennzeichnung bestätigt werden. Um detaillierte Struktur zu beobachten, wurden ultradünnen geschnittenen Bilder und negativ gefärbten Bilder von Exosomen verglichen. In diesem Protokoll empfehlen wir Transmissions-Elektronenmikroskopie für die Bildgebung von Exosomen einschließlich negative Färbung, ganze Berg Immuno-Färbung, Block Vorbereitung, Dünnschliff und Immuno-Gold Kennzeichnung.

Derzeit sind Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie in Größe und Form Kategorien eingeteilt. Abbildung 2 zeigt negative Exosom und immun-gekennzeichnete Exosom im ganzen Zuordnungsstatus gebeizt. Abbildung 3 zeigt geschnittenen Exosom und Immuno-gekennzeichnete Exosomen nach dünn schneiden. Immuno-Gold Färbung mit Antikörpern spezifischer Proteine wird verwendet, um positiv eine Exosom identifizieren und klassifizi...

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Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Techniken für Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschließlich negative Färbung, ultradünnen schneiden für detaillierte Struktur und Immuno-Gold um die Positionen der spezifischen Proteine in Exosomen bestimmen Kennzeichnung notwendig.

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

sample-preparation-imaging-exosomes-transmission-electron

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

38.7K Aufrufe.  Asan Medical Center. Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Techniken für Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschließlich negative Färbung, ultradünnen schneiden für detaillierte Struktur und Immuno-Gold um die Positionen der spezifischen Proteine in Exosomen bestimmen Kennzeichnung notwendig.

Serie: Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Forschung

Biochemie

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Biologie

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

Verwendung von Nanoplasmon-Enhanced Scattering und Low-Magnification Microscope Imaging zur Quantifizierung von Tumor-Derivate-Exosomen

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Biotechnik

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medizin

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Mikronadelpflaster für die nachhaltige Verabreichung von Exosomen in biomedizinischen Anwendungen

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging from drug delivery and regenerative medicine to disease diagnosis and tumor immunotherapy. However, the rapid clearance by traditional bolus injection and poor stability of exosomes restrict their clinical application. Microneedles serve as a solution that prolongs the residence time of exosomes at the administration site, thereby maintaining the drug concentration and facilitating sustained therapeutic effects. In addition, microneedles also possess the ability to maintain the stability of bioactive substances. Therefore, we introduce a microneedle patch for loading and delivering exosomes and share the methods, including isolation of exosomes, fabrication, and characterization of exosome-loaded microneedle patches. The microneedle patches were fabricated using trehalose and hyaluronic acid as the tip materials and polyvinylpyrrolidone as the backing material through a two-step casting method. The microneedles demonstrated robust mechanical strength, with tips able to withstand 2 N. Pig skin was used to simulate human skin, and the tips of microneedles completely melted within 60 s after skin puncture. The exosomes released from the microneedles exhibited morphology, particle size, marker proteins, and biological functions comparable to those of fresh exosomes, enabling dendritic cells uptake and promoting their maturation.

Autor im Rampenlicht: Innovative Mikronadel-basierte Strategien für verbesserte Exosomenabgabe und Stabilität

Exosomes possess significant clinical potential, but their practical application is limited due to easy in vivo clearance and poor stability. Microneedles present a solution by enabling localized delivery by puncturing physiological barriers and dry-state preservation, thereby addressing the limitations of exosome administration and expanding their clinical utility.

Herstellung und Charakterisierung von Mikronadelpflastern für das Laden und Verabreichen von Exosomen

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Verwendung von Nanoplasmon-Enhanced Scattering und Low-Magnification Microscope Imaging zur Quantifizierung von Tumor-Derivate-Exosomen

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Herstellung und Charakterisierung von Mikronadelpflastern für das Laden und Verabreichen von Exosomen

Herstellung und Charakterisierung von Mikronadelpflastern für das Laden und Verabreichen von Exosomen

Herstellung und Charakterisierung von Mikronadelpflastern für das Laden und Verabreichen von Exosomen

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur