Wir danken Dr. Till Böcking für das ursprüngliche Einzelmolekül-Vorbereitungsprotokoll. 
Diese Arbeit wurde durch den NSF-Zuschuss 1121972(SS) unterstützt.

<ol>
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Die Autoren haben in dieser Zeitung keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Als alternative Methode zur CryoEM-Tomographie kann eine Einzelvirion-Bildgebung mit AFM und hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden. Jede dieser Methoden hat ihre spezifischen Stärken. Zum Beispiel kann AFM auf WT Virionen ohne Anforderung auf Diepging der Probe oder der internen viralen Proteine durchgeführt werden. Die Lage viraler Strukturen ist von ihren Beiträgen zu den elastischen Eigenschaften der Virion entkoppelt.
Single Virion Super-Resolution Imaging in Kombination mit den neu entwickelten viralen Reverse genetischen Ansätzen wird eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung der niedrigen Kopierzahl viraler Proteine20. Rekombinante Viren mit Ersatz ihrer Proteine durch Proteine, die zu fluoreszierenden Proteinen verschmolzen sind, können mit diesen umgekehrten genetischen Ansätzen hergestellt und gereinigt werden. Obwohl die Superauflösungsabbildung zum Teil aufgrund der genetischen Kennzeichnung Spezifität hat, erfordert sie die Verwendung der mutierten Viren.
AFM und Super-Resolution Imaging sind kostenlose Methoden, die sehr ähnliche Probenpräparate verwenden. Die in diesem Papier beschriebenen Methoden, die von früheren Einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen werden, ermöglichen die Verankerung einzelner Virionen mit geringen Auswirkungen auf die Topologie der Virionen.

Ladungsbasierte unspezifische Wechselwirkungen werden routinemäßig zur Adhäsion von Virionen in der Atomkraftmikroskopie1,2verwendet. Diese Techniken funktionieren besonders gut, wenn sie auf nicht umhüllten Virionen mit sehr steifen Kapsids3-6verwendet werden. Obwohl diese Techniken sehr effektiv bei der Immobilisierung der Probe sind, verhindern sie nicht die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche. Die unspezifische Bindung kann ein Problem verursachen, wenn versucht wird, Virionen mit AFM und super-Resolution-Fluoreszenztechniken abzubilden, die Inkubationen der Probe mit verschiedenen Antikörpern erfordern. Hier skizzieren wir eine Beispielvorbereitungsmethode für die spezifische Immobilisierung von Virions.
Poly(Ethylenglykol) (PEG) mit Poly(L-Lysin) (PLL) veredelt und auf eine Glasoberfläche adsorbiert stellt einen signifikanten Block für die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen mit Glas7. Einzelmolekül-Assays, die eine Immobilisierung einzelner Moleküle auf Glasoberflächen erfordern, haben diese Eigenschaft genutzt und sie verwendet, um eine spezifische PEG-basierte Einzelmolekül-Immobilisierungstechnik8-10zu erstellen. Dieses Präparat wurde auch verwendet, um Clathrinkäfige auf die Glasoberfläche11 zu immobilisieren sowie eine homogene Fibronectin-Beschichtung für die Kontrollzellhaftung 12zu schaffen.
Wir haben das Probenvorbereitungsverfahren auf DerGrundlage der PLL-g-PEG-Adsorption auf Glasoberflächen aus bildgebenden Methoden für einzelne Moleküle übernommen und auf bildgebende Einzelvirionen des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) angewendet. Diese einzelnen Virionen wurden mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie (AFM) abgebildet. Ähnliche Experimente wurden auch an funktionalisierten Perlen als Kontrolle durchgeführt. Die Virionen wurden auch durch superhochauflösende Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, wenn ein VSV-G-Antikörper mit Alexa 647 beschriftet wurde, um ein Bild der Umhüllung einzelner Virionen zu erstellen. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung nutzt die Lokalisierung einzelner Moleküle, um ein Bild13-15zu erstellen. fPALM bi-planare Bildgebung ermöglicht die Lokalisierung einzelner Moleküle mit 20 nm in der Ebene und 50 nm Auflösung entlang der optischen Achse15,16. Diese biplanare Technik wurde verwendet, um in dieser Studie enthaltene fluoreszierende Bilder mit superauflösung abzubilden. Eine alternative Technik, die ähnliche Ergebnisse hat, ist STORM13,17,18.
Sowohl AFM als auch superhochauflösende fluoreszierende Bilder von VSV, die durch die in diesem Papier beschriebenen Verfahren am Glas verankert sind, zeigten eine spezifische Bindung von Virionen an das Glas mit minimalen unspezifischen Wechselwirkungen19. Hier stellen wir die Probenvorbereitungsprotokolle für die AFM- und super-resolution fluoreszierenden Bildgebungsexperimente vor. Kurz gesagt: Saubere Glasabdeckungen werden funktionalisiert, indem eine Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin adsorbiert wird. Es ist typisch für diesen dünnen Film, der entwickelt werden kann, um zwischen 15-25% funktionalisiertes Biotin auf einer beschichteten Oberfläche zu liefern. Die Coverlips werden weiter mit tetramerischem Avidin inkubiert. Ein biotinylierter viraler Antikörper wird dann verwendet, um eine einzigartige Bindungsstelle für die Virionen zu schaffen. Die Bindung des Antikörpers kann auf zwei Arten erfolgen.
Die erste Methode ist für AFM optimiert, bleibt jedoch für die Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung geeignet. Bei diesem Verfahren wird die avidinbeschichtete Oberfläche vor der viralen Adhäsion mit biotinylierten Antikörpern behandelt. Die immobilisierten Virionen werden mit Alexa 647-beschrifteten Antikörpern behandelt, um die Hülle zu bedecken und eine superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung der Virionen zu ermöglichen.
Die zweite Methode besteht darin, das Virus in Lösung mit dem biotinylierten Antikörper und dem von Alexa 647 markierten Antikörper anzugreifen, bevor die Viren an der mit Avidin behandelten Oberfläche haften; Diese Methode ist für superauflösende Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente optimiert, bei denen die Wiederherstellung der viralen Hülle wichtig ist. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass eine gleichmäßige Antikörperbeschichtung auf der viralen Oberfläche möglich ist. Der biotinylierte Antikörper kann mit Alexa 647 als virale Antikörper in Verhältnissen vermischt werden, die eine ausreichende Adsorption des Virus auf die mit Avidin behandelte Oberfläche ermöglichen und gleichzeitig eine hohe Konzentration an fluoreszierendem Etikett an der Außenseite der viralen Hülle beibehalten. Diese Alexa 647 markierten viralen Antikörper sind nicht biotinyliert und ihr Überschuss kann wegspült werden, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips (fPALM)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72225-01</td><td>25 mm Coverslips</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&amp;nbsp;</td><td>SuSoS</td><td>-</td><td>Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>NeutrAvidin biotin-binding protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 in 0.2 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-VSV-G&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 in 0.2 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Catalase from Bovine liver&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cysteamine (MEA</td></tr><tr><td>Stock Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CIRCLE #1</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

Die Immobilisierung von Virionen auf Glasoberflächen ist ein entscheidender Schritt in der Einzelvirionen-Bildgebung. Hier stellen wir eine Technik vor, die aus einzelmolekül-Bildgebungs-Assays übernommen wird, die die Haftung einzelner Virionen auf Glasoberflächen mit Spezifität ermöglicht. Diese Zubereitung basiert auf der Veredelung der Glasoberfläche mit einer Mischung aus PLL-g-PEG und PLL-g-PEG-Biotin, der Zugabe einer Avidinschicht und schließlich der Bildung von Virionankern durch Anhaftung biotinylierter virusspezifischer Antikörper. Wir haben diese Technik in einer Reihe von Experimenten angewendet, einschließlich der Atomkraftmikroskopie (AFM) und der superauflösenden Fluoreszenz-Bildgebung. Diese Probenvorbereitungsmethode führt zu einer Kontrollhaftung der Virionen an der Oberfläche.

Einzelvirionen-Bildgebung mit AFM:
Das oben beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll wurde bei der Verankerung von Wildartenvirionen an der Glasoberfläche verwendet. VSV-Virionen sind kugelförmig mit einer Länge von 180 nm und einem Durchmesser von 80 nm. Da es eine Vielzahl von Virions gibt, für die diese Technik angewendet werden kann, wird das Konzept auch hier auf biotinylierten 36 nm Perlen demonstriert. Die resultierenden AFM-Experimente sind in Abbildung 1dargestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die VSV-Virionen einen niedrigeren Young-Modul (100 MPa) im Vergleich zu den nicht umhüllten Viren (GPa) haben. Die besonderen Bilder von Single Virion VSV wurden im Abstichmodus unter Umgebungsbedingungen mit einem steifen Ausleger erhalten. Das Ziel war es, das Virus so weit zu verformen, dass die zusätzliche Proteindichte innerhalb des Virus als Beule innerhalb des AFM-Bildes sichtbar wird. Diese Methode wird verwendet, um die zusätzliche Proteindichte innerhalb der Virushöhle19zu erkennen.
Einzelvirion Super Auflösung Bildgebung:
Alexa 647 mit VSV-G-Antikörpern beschriftet wurden verwendet, um die Hülle einzelner VSV-Virionen für Super-Auflösungsexperimente mit Methode 5A zu beschichten. Um die Tetheringdichte und die geringe unspezifische Bindung zu veranschaulichen, ist in Abbildung 2Aein großer Scan der Probe dargestellt. Die Wiederherstellung des viralen Umschlags auf einer repräsentativen Virion ist in Abbildung 2B (blaue Isooberfläche) dargestellt.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Abbildung 1. AFM-Bildgebung von Perlen und VSV auf der funktionalisierten PEGG-Oberfläche. AFM-Scan von 36 nm biotinylierten Perlen (A, B) und einem VSV Virion (C), der mit einem biotinylierten VSVG-Antikörper an der Oberfläche verankert ist. AFM wurde im AC-Luft-Topographie-Scan-Modus durchgeführt. Der Spitzenradius beträgt <25 nm und Messungen wurden unter Kraftmodulation und Lichtabstich durchgeführt. Die Spitze hatte eine Kraftkonstante von 3 N/m und Resonanzfrequenz 75 kHz mit einer Unsicherheit von 15 kHz. Während die Perlen während des AFM-Scans ihre Höhe beibehalten haben, hat das VSV Virion einen deutlich kleineren Jungmodul und ist in der Höhe deutlich verformt. In diesem Bild wurde das Virion speziell mit einem steifen Ausleger im Abstichmodus abgebildet, der eine kleine xy-Konvolution erzeugte (zur Bestimmung der Spitze vs. stumpfes Ende des Virus) und der Höhenunterschied zwischen der Spitze und dem stumpfen Ende des Virus wird verwendet, um zusätzliche Proteindichte am stumpfen Ende des Virus19zu erkennen.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Abbildung 2. Fluoreszenzbasierte Abbildung von VSV-Virionen auf der funktionalisierten Oberfläche von PEGG. A) rekombinante VSV-Virionen, die auf der PEGG-Oberfläche mit einem biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper in Weitfeldfluoreszenz immobilisiert wurden. B) Hochauflösende Fluoreszenzrekonstruktion der Anhüllung von VSV, die durch einen biotinylierten Anti-VSVG-Antikörper an der PEGG-Oberfläche befestigt ist und mit Alexa 647-beschrifteten Anti-VSVG-Antikörpern verziert ist (Methode 5A wurde zur Erstellung dieser Bilder verwendet). Die blaue Oberfläche ist eine 2D-Isooberflächenprojektion. Links zeigt ein Modell des kugelförmigen Virus. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Coverslip Größe</td>
			<td style="width:93px;">Flüssigkeit</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 l</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Fluid aliquots nach Deckslipgröße.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Biology

9.6K Aufrufe.  University of Utah. Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Serie: Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Forschung

Ingenieurwesen

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Immunologie und Infektion

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Entwicklungsbiologie

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and chemical composition of sample with nanoscale resolution. By combining AFM with IR, the spatial resolution limitation of conventional IR is overcome, enabling a resolution of 20&#8211;100 nm to be achieved. This opens the door for a broad array of new applications of IR toward probing samples smaller than several micrometers, previously unachievable by means of conventional IR microscopy. AFM-IR is eminently suited for bacterial research, providing both spectral and spatial information at the single cell and intracellular level. The increasing global health concerns and unfavorable future prediction regarding bacterial infections, and especially, rapid development of antimicrobial resistance, has created an urgent need for a research tool capable of phenotypic probing at the single cell and subcellular level. AFM-IR offers the potential to address this need, by enabling detail characterization of chemical composition of a single bacterium. Here, we provide a complete protocol for sample preparation and data acquisition of single spectra and mapping modality, for the application of AFM-IR toward bacterial studies.

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) provides a powerful platform for bacterial studies, enabling to achieve nanoscale resolution. Both, mapping of subcellular changes (e.g., upon cell division) as well as comparative studies of chemical composition (e.g., arising from drug resistance) can be conducted at a single cell level in bacteria.

Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Chemie

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It is extremely desirable to pair high-resolution cryo-EM information with dynamic observations as many events occur at rapid timescales - in the millisecond range or faster. Improved knowledge of flexible structures can also assist in the design of novel reagents to combat emerging pathogens, such as SARS-CoV-2. More importantly, viewing biological materials in a fluid environment provides a unique glimpse of their performance in the human body. Presented here are newly developed methods to investigate the nanoscale properties of virus assemblies in liquid and vitreous ice. To accomplish this goal, well-defined samples were used as model systems. Side-by-side comparisons of sample preparation methods and representative structural information are presented. Sub-nanometer features are shown for structures resolved in the range of ~3.5-&#197;-10 &#197;. Other recent results that support this complementary framework include dynamic insights of vaccine candidates and antibody-based therapies imaged in liquid. Overall, these correlative applications advance our ability to visualize molecular dynamics, providing a unique context for their use in human health and disease.

Here protocols are described to prepare virus assemblies suitable for liquid-EM and cryo-EM analysis at the nanoscale using transmission electron microscopy.

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Biochemie

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Biologie

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...