Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

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	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das Protokoll hier vorgestellten wurde für die Verarbeitung von verschiedenen kultivierten Zelllinien (H1 und H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) und primäre Gewebeproben (Maus-Knochenmark, embryonale Maus-Leber, Maus Erwachsenen erfolgreich eingesetzt Leber, die Maus-Tumor). Unabhängig von der Quelle, jedes Gewebe, das in einzelne Zellen dissoziiert werden kann, während der zelluläre Zustand bewahren sollte Zytometrie zur Analyse von Massen zugänglich sein, sondern kann eine Protokolloptimierung e...

Cytometry ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Antikörper Ziele in einer einzelnen Zelle Ebene über große Populationen von Zellen. In herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie, die Anzahl der Parameter, die quantifiziert werden kann, wird durch spektrale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum von mehreren Fluorophoren begrenzt, die immer komplexer werdenden Kompensationsberechnungen wie die Anzahl der Parameter ansteigt erfordert. Diese Einschränkungen werden durch Massen adressiert Cytometry, wo Schwermetall-konjugierten Antikörper nachgewiesen werden, und durch Flugzeit (TOF) Massenspektrometrie quantifizieren stark die Anzahl der Parameter gesammelt gleichzeitig expandiert und ein hohes Dimensionsprotein Überfluß Profil für jede einzelne Zelle zu ergeben. Ein grundlegendes Verständnis der Funktionsweise des Massen Zytometrie Instrument ist für den Benutzer von Vorteil und kann für die Fehlersuche wesentlich sein. Für eine ausführliche Beschreibung der Abstimmung und eine Masse-Zytometrie Maschine ausgeführt wird,finden Sie im verwandten Manuskript 1. Kurz gesagt, wird eine Zellprobe mit einem Panel von Antikörpern , konjugiert Metallzielzelloberflächenmarker, cytoplasmatische Proteine, nukleäre Proteine, Chromatin-gebundene Proteine oder andere Epitope von Interesse (Figur 1i) markiert. Die markierten Zellen werden auf die Maschine geladen wird, entweder einen nach dem anderen durch manuelle Injektion oder mit Hilfe eines automatischen Probennehmer, dass die Proben von einer 96-Well-Platte. Die beladenen Zellen werden durch einen Zerstäuber injiziert wird , die einen Sprühnebel aus Flüssigkeitströpfchen erzeugt , um die Zellen einkapseln (Abbildung 1II). Dieses Spray wird so positioniert, dass die Zellen durch einen Argonplasmabrenner ionisiert werden. Diese Ionisierung erzeugt eine Partikelwolke aller konstituierenden Atome jeder Zelle (Abbildung 1III) umfasst. Da diese Partikelwolke zu dem Detektor bewegt werden geringe Atommassen Atome aus den Ionen mit hohen Masse durch einen Quadrupol-Massenfilter getrennt. Die verbleibenden Ionen mit hohen Masse weiter zu dem Detektor, wo der abundance jedes Isotop wird (Abbildung 1IV) quantifiziert. Die Rohdaten vom Detektor gesammelt werden, werden von den Massen Cytometry Gerätesoftware analysiert, um Zellereignisse zu identifizieren. Für jedes identifizierte Zelle Ereignis, das Signal in jedem Kanal detektiert wird quantifiziert und mit einem Ausgang .fcs Datei gespeichert. Die Massenkanäle verwendet für das Schwermetall konjugiert Nachweis von Antikörpern eine minimale spektrale Überlappung, die mit den meisten Beiträgen unter 1% von 0-4% liegt. Aufgrund dieses geringen Übersprechens zwischen den Kanälen, ist es in der Regel nicht erforderlich , die Daten mit einer Kompensationsmatrix vor der Analyse 2 zu transformieren. Allerdings sollte Sorgfalt bei der Gestaltung der experimenteller Gruppe von Antikörpern getroffen werden, um sicherzustellen, dass ein Antikörper mit einem Hochfluss-Epitop nicht zu einem Masse Kanal zugeordnet ist, das Signal an einen Kanal zu einem Low-Fülle-Antikörper, da dies zugewiesen trägt eine künstlich hohe Population in dem Kanal erzeugt den Signalbeitrag zu empfangen. <p class = „jove_content“&gt; Die genaue Vorbereitung von Proben für Massen Zytometrie-Analyse ist in hohem Maße abhängig von den Typen von Proben gesammelt und die experimentelle Hypothese getestet. Wir stellen Beispiele für zwei Protokolle für die Ernte verschiedene Arten von Zellen (menschliche embryonale Stammzellen) und primäre Zellen (Maus-Brusttumor-Epithelzelle Isolat). Wenn eine Masse Zytometrie Studie beginnen, ist es ratsam, einen kleinen Pilotversuch zum ersten führen, um sicherzustellen, dass alle Protokolle und Antikörpern genutzt werden arbeiten gut in der Hand des Prüfers. Dies ist besonders wichtig, wenn benutzerdefinierte sind konjugierte Antikörper verwendet werden, da die partielle Reduktionsreaktion während der Antikörper-Konjugation hat das Potenzial, Antikörperaffinität zu stören; Daher muss jeder individuelle Antikörper validiert werden empirisch Datengenauigkeit zu gewährleisten. Andere Überlegungen umfassen das Bestimmen, ob der Zelloberfläche Antikörper im Assay verwendet werden, werden ihre Epitope nach der Fixierung erkennen oder wenn sie need angewendet werden Zellen zu leben. Einige Fixierung verhindern richtige Färbung mit Antikörpern Zelloberfläche , wie bekannt ist , auftreten , die mit dem Peptid-MHC - Färbung 3, 4. Durchführen von Zelloberflächen - Antikörper - Färbung an lebenden Zellen kann für einige Antikörper erforderlich sein, aber dies schließt die Möglichkeit zur Antikörpermarkierung vor Strichkodierung da die meisten Strichcodes Verfahren nach der Fixierung durchgeführt werden , obwohl 5 Antikörper-basierte Strichkodierung 6, 7 ist eine Ausnahme. Bei der Bestimmung der Anzahl von Zellen für die Analyse vorbereitet werden, ist es wichtig zu wissen, dass nur ein Bruchteil der auf die Maschine geladen Zellen werden die Daten erfasst werden und produzieren. Dieser Verlust ist hauptsächlich auf Ineffizienzen, wenn der Zerstäuber um die Probe bei der Fackel Sprays. Der genaue prozentuale Verlust hängt von der Masse Zytometrie Maschinenaufbau und Zelltyp, sondern kann von 50 bis 85% liegen und solltebetrachtet, wenn das Experiment zu entwerfen. Dieses Protokoll wurde für 2x10 6 Zellen pro Probe optimiert, kann aber für die Verarbeitung von kleineren oder größeren Probengrößen angepasst werden. Dieses Protokoll kann von 1 × 10 6 bis 4 x 10 6, mit minimalen Modifikationen für Probengrößen verwendet werden , aber es ist wichtig , dass Fallzahl innerhalb eines Versuchs konsistent gehalten werden. Änderungen in der Zellzahl können die Intensität von Barcodes und Antikörper-Färbung beeinflussen und sollte in etwa konsistent gehalten werden, über Proben direkt miteinander verglichen werden. Einige Verfahren, wie tote Zellmarkierung und DNA-Markierung, sollen in der überwiegenden Mehrheit durchgeführt werden, wenn nicht alle experimentellen Designs. Die Kennzeichnung von toten Zellen in den Experimenten nur Oberflächenmarker Analyse kann mit Rh103 erreicht werden, aber Rh103 sollte für Experimente vermieden werden, in denen Permeabilisierung erforderlich ist, wie es in Färbung Verlust zur Folge hat. Für Experimente mit Permeabilisierung, ist es ratsam, Cisplatin zu nutzen Strichkodierung Proben können Antikörper Verbrauch verringern Erfassungszeit reduzieren und eliminieren Probe zu Probe Variabilität 9. Der Prozess der Strichkodierung beinhaltet einen einzigartigen probenspezifischen Code für alle Zellen Anwendung, die verwendet wird, um jede Zelle in seine Ursprungsprobe zuzuordnen. Nachdem die Proben Strichkodierung kann vor der Antikörperfärbung gepoolt werden, ein Verfahren, dass alle Proben gefärbt werden gleichermaßen gewährleistet. Um experimentelle Fehler zu minimieren, ist es ratsam, auf Barcode und bündelt alle Proben, die direkt miteinander verglichen werden. Derzeit gibt es mehrere Methoden für Strichkodierung Proben für Massen Zytometrie Analyse 5, 6, 7, von denen zwei hier vorgestellt werden (siehe unten). Mit derzeit erhältlichen reagents ist es möglich , die Fülle von 38 Antikörper Targets identifizieren Zellen in S-Phase 10, unterscheiden lebenden und toten Zellen und 8 messen zelluläre Niveaus von Hypoxie 11 in einem gemultiplexten Experiment mehrerer Proben zu quantifizieren. Diese Fähigkeit , hohe Parameter Einzelzellendaten für große Zellpopulationen zu sammeln , ermöglicht eine verbesserte Profilieren von sehr heterogenen Zellpopulationen und hat bereits eine Reihe von neuartigen biologischen Erkenntnissen 12, 13, 14, 15, 16 hergestellt. Destillieren der resultierenden komplexen Daten auf interpretierbare Informationen hat 18 die Verwendung von Computer - Algorithmen , einschließlich Spanning Tree Progression der Dichte Normalized Ereignisse (Pik) 17 und Visne erforderlich. Dieser Artikel stellt eine leicht zugänglicheÜberblick darüber, wie zu entwerfen und eine Masse-Zytometrie Experiment durchzuführen und stellt grundlegende Analyse von Massendaten-Zytometrie.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble to 25&amp;nbsp;mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2&#039;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble to 74&amp;nbsp;mg/mL in 0.2&amp;nbsp;N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 intercelating agent</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Chill at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m filter cap tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ four element calibration beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass cytometry analysis

Massen-Zytometrie verwendet mit Schwermetalletiketten konjugierte Antikörper, ein Ansatz, der stark erhöht die Anzahl der Parameter und Möglichkeiten für tiefe Analyse weit über hat, was möglich ist mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie. Wie bei jeder neuen Technologie gibt es wichtige Schritte, die die zuverlässige Erzeugung von qualitativ hochwertigen Daten sicherzustellen. Dargestellt ist hier ein optimiertes Protokoll, das mehrere Techniken für die Verarbeitung von Zellproben für die Massen Zytometrie Analyse einbezieht. Die hier beschriebenen Methoden helfen dem Benutzer häufige Fehler zu vermeiden und konsistente Ergebnisse erzielen durch Variabilität zu minimieren, die zu ungenauen Daten führen kann. Um experimentelles Design zu informieren, die Gründe für optionale oder alternative Schritte in dem Protokoll und ihre Wirksamkeit bei der Aufdeckung neue Erkenntnisse in der Biologie des Systems wird untersucht, behandelt. Schließlich wird repräsentative Daten vorgelegt erwarteten Ergebnisse der Techniken presente zu illustrierenhier d.

Das Protokoll kann hier im Großen und Ganzen auf eine große Vielfalt von gezüchteten und primären Zellproben mit nur geringfügigen Modifikationen angewandt präsentiert werden. Je nach den Anforderungen des Experiments, kann es in einer modularen Art und Weise durchgeführt werden, wenn bestimmte Elemente, wie Barcodes oder Zelloberflächenfärbung, sind nicht erforderlich. Verwendetes in seiner Gesamtheit ermöglicht dieses Protokoll, um die Herstellung von Massen gemultiplexten Cy...

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Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K Aufrufe.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Serie: Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Forschung

Biotechnik

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Entwicklungsbiologie

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Medizin

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Immunologie und Infektion

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Metabolische Studien mit geringem Input an Mäusezelltypen

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Metabolomik-Analyse seltener hämatopoetischer Stammzellen 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie