The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.

Ethik-Erklärung: Die Forschungsethik Vorstand von der Universität von Manitoba und Kenyatta National Hospital / University of Nairobi genehmigt diese Studie und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Studienteilnehmern erhalten. 1. Vorbereitung der Medien und CMC Röhrchen <ol><li> Vorbereitung phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav zum Sterilität. Dies kann bei 4 º C mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Pre-aliquote 5 ml PBS in 50 ml Falcon-Röhrchen (eine pro Probe gesammelt werden) und bei 4 º C bis zur Probenentnahme Zeit. </li><li> Beschriften 2-4 Kryoröhrchen oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe Spülung für die Lagerung zu sammeln. </li><li> Vorbereitung Zellkulturmedien: RPMI 1640 + 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B (Endkonzentration 100 Einheiten / ml, 100 ug / ml und 250 ng / ml, je wEly, ohne FCS / FBS aufgenommen. </li></ol> 2. Sammlung von Proben Cytobrush Sammlung von Proben Zytobürste ist ein nicht-invasives Verfahren, das von einem geschulten MD oder Gynäkologen durchgeführt werden müssen. <ol><li> Sammeln Gebärmutterhalskrebs mononuklearen Zellen (CMC) unter Verwendung sowohl einer Cytobrush und einem Holz-oder Kunststoffschaber. Sammeln CMC vom Teilnehmer unter Spekulumuntersuchung, indem Sie den Schaber und rund um den Muttermund dreht (Abbildung 1). Legen Sie die Cytobrush in die endocervical-Betriebssystem, um 360 ° drehen und sofort legen sowohl die Cytobrush und Schaber in die 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 5 ml PBS. </li><li> Halten Proben auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung. Um die Lebensfähigkeit der Zellen, Prozessproben innerhalb von 2 h Sammlung aufrecht zu erhalten. </li><li> Wenn möglich, sammeln abgestimmt Blutproben in grüne Spitze Heparin-Vacutainer für periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) Isolierung als Komparator / Steuerung für CMC-Analyse dienen. </li&gt; </ol> 3. Isolierung von CMC Führen Sie die Probenverarbeitung in einem Labor der Sicherheitsstufe 2, in einer sterilen Biosicherheitsschrank mit Flügelhandschuhe. <ol><li> Bei der Abholung kann CMC kontaminierten Proben mit Blut zu werden. Proben mit sichtbaren Blutkontamination aus der Studie ausschließen, um verwirrende Einbeziehung von PBMC in der letzten Probe zu verhindern. Aufgrund der geringen Anzahl von Lymphozyten von CMC-Proben isoliert, können kleine Blutkontamination leicht überwältigen die CMC-Lymphozyten-Komponente. </li><li> Wirbel-Falcon-Röhrchen, die sowohl das Zytobürste und Abstreifer für 45 Sekunden, um Zellen von den Bürsten zu dissoziieren. Proben können schaumig während dieses Prozesses zu werden; das ist normal. </li><li> Verwenden Sie die Cytobrush, um alle verbleibenden Material aus dem Schaber abkratzen, und entsorgen Sie die Schaber in ein Bleichmittel-Lösung. Um alle Zellen bleiben auf den Pinsel / Schaber angebracht sammeln, verwenden Sie einen frischen Handschuh, den Schaber zwischen Daumen und Zeigefinger zusammendrücken.Schieben Sie die Bürste, so dass die Zellen und PBS in der gleichen 50-ml-Tube gesammelt werden. Entsorgen Sie die Cytobrush in eine Bleichlösung, und entsorgen Sie den Handschuh. WICHTIG: Verwenden Sie einen neuen Handschuh für jede Probe. </li><li> Setzen Sie einen 100 um Nylon Zelle Sieb, um ein frisches 50 ml Falcon-Röhrchen. Verwendung einer Transferpipette, sammeln die PBS-Zellsuspension aus dem Probenröhrchen und dem Filter durch das Sieb in die frisches Röhrchen. </li><li> 5 ml RPMI 1640 auf die ursprüngliche Probenröhrchen. Mit der Transferpipette, waschen Sie die Seiten der Probenröhrchen mit der RPMI und übertragen durch den Filter auf das neue Sammelröhrchen. Und wäscht den Boden der Nylonfilter mit RPMI. </li><li> Zentrifugieren der Proben für 10 min bei 514 x g. Es ist entscheidend, um die Zentrifuge Brems aufhören bei diesem Schritt, um Herausziehen der CMC Pellet verhindern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der Röhre, kümmert sich um das Pellet nicht zu stören. Pelletgröße sehr unterschiedlich sein; in some Proben wird das Pellet ziemlich groß aufgrund der Anwesenheit einer großen Zahl von Epithelzellen, während in anderen Fällen ist das Pellet kaum sichtbar und hochtransparent. </li><li> Das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Falcon-Röhrchen. 5 ml PBS, um die Probe zu waschen. </li><li> Zentrifuge wieder für 10 Minuten bei 514 xg ohne Bremse Zentrifuge. </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen und wieder aussetzen das Pellet wie oben. Die Zellen sind, bereit für die Kryokonservierung (mit PBMC Kryokonservierung-Protokoll), die Stimulation oder Durchflusszytometrie Phänotypisierung. </li></ol> 4. CMC Oberflächenfärbung und Durchflusszytometrie <ol><li> Das Pellet aus Schritt 3.10 in 100 ul Blockierungslösung und Transfer entweder in eine 96-Well-Platte oder FACS-Röhrchen. Die Blockierungslösung (Fc &amp;ggr;-Rezeptoren zu blockieren) Rezeptur ist wie folgt: 1,8 ul Maus-IgG (Endkonzentration 0,2 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l), 5 &amp;mgr; l FBS und 93,2 &amp;mgr; l FACS-Wasch (PBS + 2% FBS).Die Färbung kann in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden, wenn Pelletgrößen klein genug sind, müssen aber möglicherweise in FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn Pellets sind routinemäßig groß. Es ist wichtig, Antikörper entsprechend titrieren. </li><li> Blockieren Sie die Proben für 10 Minuten auf Eis / bei 4 ° C </li><li> Mit 100 &amp;mgr; l FACS-Wash (PBS + 2% FBS) in 96-Well-Platten oder 500 &amp;mgr; l FACS-Röhrchen in die Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C mit dem Brems auf niedrig (oder aus, wenn eine niedrige Brems Einstellung nicht verfügbar ist). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet durch Bewegung. In Lebensfähigkeit Stain (Live Toten feststellbar Lebensfähigkeit Farbstoff). Vorbereitung Lebensfähigkeit Farbstoff nach den Anweisungen des Herstellers. Er muss dann für den Einsatz in jedem Labor / Durchflusszytometer Setup titriert werden. Inkubation für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen μl/500 100 ul PBS (für 96-Well-Platte / FACS-Röhrchen). Zentrifugieren bei 600 g für 10 min mit geringer / ohne Bremse. Entfernen supernatant und resuspendieren Zellen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit der Mischung aus Oberflächenmarker-Antikörper in einem Gesamtvolumen von 100 ul. WICHTIG: Optimieren und titriert jedes Durchflusszytometrie Tafel vor der Färbung zu probieren. Zellen für 30 min im Dunkeln inkubieren bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.5. wenn Anfärben in einer 96-Well-Platte, Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen und mit Wasser auf ein Endvolumen von 750 &amp;mgr; l FACS-Wash mit 1% Paraformaldehyd (PFA) (oder Cytofix, verdünnt 1 in 4). Gehen Sie zur Datenerfassung auf einem Durchflusszytometer. </li></ol> 5. Entnahme und Vorbereitung von Gebärmutterhalskrebs Vaginal Lavage (CVL) <ol><li> Vor der Entnahme Cytobrush, verwenden Sie eine Spritze, um die Endocervix mit 2 ml steriler PBS waschen und saugen Sie den Spülung aus dem hinteren Scheidengewölbe. </li><li> Sammeln Sie die angesaugte Spülung Probe in ein 15 ml Falcon-Röhrchen und halten auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung. </li><li> Zentrifuge Proben bei 400 × g für 7 min, um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Collect der Überstand, Aliquot der Probe in 1 ml oder 500 ul Aliquots und bei -70 ° C Aliquots können ELISA-oder Perlen Array Analyse der CVL Proteine ​​aufgetaut werden, aber vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren / Auftauen. </li><li> Wenn gewünscht, das Pellet von Zelltrümmern in RNA später RNA-Expression durch folgende Protokoll des Herstellers gemessen. </li></ol> 6. Datenerfassung <ol><li> Einen Satz der Vergütung Rohre, die den Antikörper-Panel passt. Führen Sie die Ausgleichsrohre spektrale Überlappung einzustellen. Führen Sie die Proben auf jedem Multicolor Durchflusszytometer, dass ist für den Fluorochrom konjugierte Antikörper in der Gruppe verwendet, konfiguriert. </li><li> Erwerben Sie eine Probe PBMC erste Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Spannung, um die Lymphozytenpopulation erkennen einzustellen. Versuchen, sie bei 100 auf jeder Achse auf einer linearen Skala zu halten. Ausführen eines PBMC Steuer wird es deutlich einfacher, die CMC Lymphozyten-Population zu finden. </li><li> Das FSC-Schwelle für die CMC-Proben müssen in Bezug auf PBMC-Proben wegen zu niedrigen Werten FSC schmieren die SSC-Achse erhöht werden. </li><li> Mischen Sie jedes Rohr vor dem Erwerb. Erwerben das gesamte Rohr, die Anzahl der Lymphozyten-Gate Ereignisse gesammelt maximieren. Überwachen Sie die Maschine sorgfältig, um ein Verstopfen zu vermeiden. </li><li> Exportieren der Daten in eine durchflusszytometrische Analyse Programm wie FlowJo. </li></ol> 7. Gating-Strategie <ol><li> Wählen Sie Weiterleiten Seitenstreuung hoch (FSC-H) / Vorwärts Seitenstreubereich (FSC-A) die Singulett-Bevölkerung zu bestimmen. </li><li> Wählen Sie Zeit gegen Fluoreszierende Marker (wie zB FITC) für die Qualität der Akquisition steuern. Änderung der Strömungsrate kann zu Artefakten in den Daten einzuführen. Schließen Sie alle mögliche Fläche, die Diskrepanz in der Fließgeschwindigkeit zeigt. </li><li> Identifizieren Sie die Lymphozyten-Population auf SSC-A/FSC-A Handlung. Verwenden Sie einen PBMC Steuerung, um die Identifizierung zu erleichtern. Beachten Sie, dass die CMC Lymphozyten-Population vielleicht nicht so klar wie die PBMC Kontrolle. &lt;/ Li&gt; <li> Tor auf SSC-A/viability färben, um tote Zellen von lebenden Zellen auszuschließen. Tote Zellen können nicht-spezifisch zu integrieren, die Antikörper, die Artefakte vorstellen wird. </li><li> Tor auf der SSC-A/CD3, um die T-Zellpopulation zu identifizieren. Von diesem Tor, identifizieren die CD4 + und CD8 +-Populationen. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNAIDS.+Global+Report+2013.">UNAIDS. Global Report 2013.</a> http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+anti-HIV+immune+responses+in+the+female+reproductive+tract.">Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract.</a> Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).</li><li>Douek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+disease+progression:+immune+activation,+microbes,+and+a+leaky+gut.">HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut.</a> Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).</li><li>Hofer, U., Speck, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance+of+the+gut-associated+lymphoid+tissue+is+associated+with+disease+progression+in+chronic+HIV+infection.">Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection.</a> Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).</li><li>Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+in+the+female+genital+tract:+discrete+influence+of+the+local+mucosal+microenvironment.">HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment.</a> American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).</li><li>Hladik, F., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+of+the+genital+mucosa+in+women.">HIV infection of the genital mucosa in women.</a> Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).</li><li>Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+fluid+induces+leukocyte+recruitment+and+cytokine+and+chemokine+mRNA+expression+in+the+human+cervix+after+coitus.">Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus.</a> Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).</li><li>St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+activation+and+maturation+induced+by+mucosal+fluid+from+women+with+bacterial+vaginosis.">Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis.</a> Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).</li><li>Liebenberg, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+transport+of+cervical+cytobrushes+for+isolation+of+mononuclear+cells+from+the+female+genital+tract.">Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract.</a> Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).</li><li>Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+distribution+of+HIV-binding+CCR5+and+C-type+lectin+receptors+in+the+human+endocervical+mucosa.">In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa.</a> PloS one. 6, (2011).</li><li>Hasselrot, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+and+safety+of+cervical+biopsy+sampling+for+mucosal+immune+studies+in+female+sex+workers+from+Nairobi,+Kenya.">Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials:+an+international+multi-site+study.">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Lajoie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+cytokine+and+chemokine+profile+at+the+genital+mucosa+is+associated+with+HIV-1+protection+among+HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers.">A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers.</a> Mucosal immunology. 5, (2012).</li><li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Proteomic+Study+Identifies+Serpin+and+Cystatin+Antiproteases+as+Novel+Correlates+of+HIV-1+Resistance+in+the+Cervicovaginal+Mucosa+of+Female+Sex+Workers.">Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers.</a> Journal of proteome research. 10, (2011).</li><li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+examination+of+the+human+female+genital+tract+shows+compartmentalization+of+immune+factor+expression.">A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression.</a> Journal of virology. 87, (2013).</li><li>Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+T+cell+responses+detected+in+the+genital+tract+of+chronically+HIV-infected+women+are+largely+monofunctional.">HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional.</a> Immunology. 139, (2013).</li><li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Human+Cervical+CD4++T+Cell+Subset+Coexpressing+Multiple+Markers+of+HIV+Susceptibility.">Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility.</a> Journal of immunology. , (2011).</li><li>Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyclonal+expansion+of+cervical+cytobrush-derived+T+cells+to+investigate+HIV-specific+responses+in+the+female+genital+tract.">Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract.</a> Immunology. 130, 23-33 (2010).</li><li>Iqbal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+T+cell+counts+and+RANTES+expression+in+the+genital+mucosa+of+HIV-1-resistant+Kenyan+commercial+sex+workers.">Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers.</a> The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).</li><li>Hirbod, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+CD4+expression+and+local+immune+activation+in+the+ectocervical+mucosa+of+HIV-infected+women.">Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women.</a> Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).</li><li>Horton, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+gene+expression+patterns+and+cell+phenotypes+between+cervical+and+peripheral+blood+mononuclear+cells.">A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Begaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+CD4+T+cell+activation+and+in+vitro+susceptibility+to+HIV-1+infection+in+exposed+uninfected+Central+Africans.">Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans.</a> Retrovirology. 3, 35 (2006).</li><li>McLaren, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers+show+a+quiescent+phenotype+in+the+CD4++T+cell+compartment+and+reduced+expression+of+HIV-dependent+host+factors.">HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors.</a> The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).</li><li>Card, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Cellular+Susceptibility+to+In+Vitro+HIV+Infection+Is+Associated+with+CD4T+Cell+Quiescence.">Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Prodger, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreskin+T-cell+subsets+differ+substantially+from+blood+with+respect+to+HIV+co-receptor+expression,+inflammatory+profile,+and+memory+status.">Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status.</a> Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).</li><li>Reusch, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopy+and+ultrasound+imaging+of+human+cervical+structure.">Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure.</a> Journal of biomedical optics. 18, (2013).</li><li>Oertelt-Prigione, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+and+the+menstrual+cycle.">Immunology and the menstrual cycle.</a> Autoimmunity reviews. 11, (2012).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+serpin+A1+and+A3+levels+in+HIV+highly+exposed+sero-negative+women+are+affected+by+the+menstrual+cycle+and+hormonal+contraceptives+but+are+independent+of+epidemiological+confounders.">Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders.</a> American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Angesichts der großen Wissenslücken in Bezug auf die Immunität im weiblichen Genitaltrakt (FGT), können phänotypische Analyse von CMC eine breite Palette von Einsichten in verschiedene Lymphozyten-Populationen in den Gebärmutterhals zu liefern. Mit Proteomanalyse und Viruslastmessungen in den zervikalen Spülung gekoppelt, kann Immunität zu sexuell übertragbaren Infektionen (STI) s und andere Krankheitserreger in verschiedenen Populationen zerschnitten werden. Technische Übe...

Die Mehrheit der HIV-Neuinfektionen weltweit durch heterosexuelle Übertragung entstehen, mit Frauen, die 47% der Neuinfektionen im Jahr 2011 (UNAIDS 1). Das Verständnis der weiblichen Genitaltraktes (FGT), einer der Haupteingangsportale für HIV und andere sexuell übertragbare Erreger, ist von großer Bedeutung auf dem Weg zur Suche nach effizienten Strategien, um Infektionen zu vermeiden. Immunantworten im Genitalschleimhaut deutlich einzigartig und unterscheiden sich von denjenigen im peripheren Blut 2 gemessen. Allerdings ist die Kenntnis der aktuellen Immundynamik an der FGT allenfalls begrenzt. Bisher haben Studien der Schleimhautimmun Umwelt weitgehend auf den Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT), wo es ist klar geworden, dass die frühen Ereignisse im Schleimhautgewebe nach der Infektion einen starken Einfluss auf nachfolgende Fortschreiten der Krankheit 3,4 haben konzentriert. Sammelproben aus der Genitalschleimhaut stellt eine große Herausforderung und ist zumindest teilweise verantwortlich für die lack Verständnis der Immunologie der FGT. Die Lösung des Rätsels der Immun Dynamik zwischen Wirt und Pathogen in Zusammenhang mit der Umwelt, die die unterschiedlichen FGT erfordert effiziente Methoden zur Erfassung und Analyse von Proben aus diesem Gebietsschema ist. Die FGT ist in zwei Abschnitte unterteilt: der obere Fortpflanzungsorgane, die die Eileiter, Endometrium und Endocervix und den unteren Darm-Trakt, die die Ektozervix enthält und die Vagina enthält (von Kaushic prüft et al 5). Es ist immer noch unklar, was der relative Beitrag dieser verschiedenen Websites ist es, HIV-Infektion, aber es wird angenommen, dass beide Seiten könnten, um HIV-Eintritt 6 beitragen. T-Zellen repräsentieren 40-50% der Leukozyten in den oberen und unteren Fortpflanzungsorgane, während Makrophagen umfassen ca. 10% (in Rodriguez-Garcia et al Bewertung 2). T-Zellen können in der Vagina, Gebärmutterhals, Endometrium nachgewiesen werden. Makrophagen sind stärker localiim Endometrium und Myometrium-Bindegewebe als der Zervix zed, obwohl sie in beiden Geweben nachgewiesen werden. Schließlich kann plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) und Langerhans-Zellen auch in FGT Gewebe nachgewiesen werden. Der Phänotyp und Proportionen von Immun Populationen und ihrer Anfälligkeit für eine HIV-Infektion kann allem je nach Hormonzyklen, die Verwendung von hormonellen Kontrazeptiva, bakterielle Vaginose oder sexuelle Aktivitäten 5,7-9. Diverse Verfahren sind entwickelt worden, um die Immun Populationen und der Umgebung des FGT studieren. Cervical Biopsie-, Gebärmutterhals-und cytobrushes zervikovaginalen Spülungen (CVL) 10-12 sind die am häufigsten in der Literatur verwendet. CVL Sammlung von PBS Spülung ist das einfachste Verfahren und erlaubt die Untersuchung der immunmodulierenden Proteine ​​führt jedoch zu extrem niedrigen Zellausbeute und eignet sich deshalb nicht für die Untersuchung der Immunzellpopulationen der FGT 13. CVL Proben andererseits vEry nützlich für die Bewertung der Immun Umgebung der FGT durch Messung der Expression von verschiedenen Zytokinen, Chemokinen oder antimikrobielle Faktoren unter Verwendung von Verfahren, wie ELISA, Cytokin Perlenanordnung 14 oder Massenspektrometrie 15,16. Charakterisierung der Immunzellfrequenzen Phänotypen und Funktionen können durch Sammeln zervikalen mononukleären Zellen (CMC), durch zervikale Zytobürste oder durch zervikale Biopsieprobennahme erreicht wird. Cervical Biopsien ist eine invasive Methode, die die Beschwerden und das Risiko von Blutungen erhöht und nimmt 2 bis 11 Tage, um zu heilen nach dem Verfahren je nach Immunstatus der Frau 12. Auf der anderen Seite, Gebärmutterhals cytobrushes trotz der geringeren Ausbeute an Zellen gesammelt, ist eine weniger invasive und bequeme Methode, um die Immunzellen aus dem FGT sammeln. Beide Verfahren können die gleiche Ausbeute an CD45 +-Leukozyten zu erreichen, aber zwei aufeinander zervikalen cytobrushes sind notwendig, um die gleiche Menge an Zellen enthielt, erhalten wurde in ein Biopsie-13. Dennoch bietet immer noch Zytobürste Probenahme eine zulässige Anzahl von Zellen (etwa 5000 Zellen CD45 + / Zytobürste) für weitere ex vivo Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie 14. Außerdem können funktionelle Charakterisierung an diesen Proben durchgeführt werden, wie Stimulation und intrazelluläre Durchflusszytometrie oder qPCR wurden unter Verwendung von CMCs Zytobürste abgeleiteten HIV-spezifischen Immunantworten 17 oder Th-Zell-Polarisation 18 zu identifizieren. Erweiterung der T-Zellen können auch Bevölkerung erleichtern funktionelle Studien mit CMC 19. Es ist wichtig zu beachten, dass Biopsien und cytobrushes Probe unterschiedliche Abschnitte der FGT. Biopsien sind von der überlegenen Teil des Epithel und Stroma der Ektozervix 12,13 abgeleitet, während Gebärmutterhalskrebs cytobrushes probieren Sie die Muttermundes, Sammeln von Zellen aus dem Epithel der Endocervix und vermutlich der Transformationszone abgeleitet. Cytobrush Proben daher probieren Sie eine Wiedergion aus einer einzigen Schicht von Epithel besteht, während Biopsien, umfassen einen Bereich von einem geschichteten Plattenepithel Epithel 5 ausgekleidet. Als Folge der Natur der Leukozyten-Populationen durch zervikale Biopsie und Zytobürste gesammelt unterscheidet. Biopsien sammeln einen höheren Anteil an CD3 +-T-Zellen, während cytobrushes führen Sammlung von einem höheren Anteil an CD14 + Monozyten / Makrophagen 13. Das Studium der Immunologie der FGT ist seit vielen Jahren 20-22 ein Interesse, und wir haben viel Know-how mit dem Studium der Cytobrush abgeleitete CMC angesammelt. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich vor allem auf die Untersuchung von HIV-infizierten, nicht-infizierten und HIV-seronegativen ausgesetzt (HESN) Sexarbeiterinnen aus Nairobi, Kenia. HIV repliziert vorzugsweise in aktivierten T-Zellen 23 und eine geringere Anzahl an aktivierten Zellen, die von HIV in der FGT richtet werden kann, könnte den Schutz vor HIV-Ansteckung bei. Im Einklang mit dieser Hypothese mehrere studies wurden geringere Immunaktivierung unter HESN Sexarbeiterinnen, die hoch HIV ausgesetzt werden beschrieben bleiben doch nicht infizierten 24,25, und das Ruhe Phänotyp ist auch in der FGT 14 beobachtet. Hier beschreiben wir Methodik für die Verarbeitung und Bewertung von T-Zellen-Aktivierung in CMC-Proben von Gebärmutterhalskrebs cytobrushes durch ex vivo Durchflusszytometrie abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer for 50 ml Falcon tube</td><td>BD</td><td>352360</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life technology</td><td>16000044</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life technology</td><td>15290-018</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ml</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>Blood Bank disposable transfer pipette</td><td>Fisher</td><td>13-711-6M</td><td>CMC processing</td></tr><tr><td>Cytobrush plus</td><td>Cooper surgical</td><td>C0121</td><td>CMC sampling</td></tr><tr><td>Disposable cervical scraper</td><td>Quick medical</td><td>2183</td><td>CMC sampling</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube</td><td>Fisher</td><td>14-959-70c</td><td>CVL processsing</td></tr><tr><td>1.5 ml tube Eppendorf</td><td>Fisher</td><td>05-402-18</td><td>CVL storage</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td>Flow cytometry reagent</td></tr><tr><td>Fixation buffer (4% PFA)</td><td>BD</td><td>554655</td><td>Flow cytometry regeant</td></tr><tr><td>IgG mouse</td><td>Sigma</td><td>I8765</td><td>Flow cytometry regeant</td></tr></tbody></table>

collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Multi Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Phänotypen und Funktionen der Zell-Untergruppen in bisher nicht charakterisiertes Gewebe zu sezieren. Analyse von CMC Proben können Informationen sowohl Lymphozyten und Monozyten-Populationen mit entsprechenden Gating Strategien ergeben. Ein Vertreter CMC Gating-Strategie, im Vergleich zu einem angepassten PBMC-Profil, ist in Abbildung 2 dargestellt. Das FSC-A gegen FSC-H ermöglicht Grundstück für den...

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples at JoVE.com

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

collection-isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

19.0K Aufrufe.  University of Manitoba. The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays. 

Serie: Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

Isolierung der menschlichen Endothelzellen aus normalen Colon und kolorektalen Karzinom - eine verbesserte Protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Forschung

Krebsforschung

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, and nucleic acids originating from normal tissues, but some of these substances also originate from the diseased area. The investigation and analysis of these substances in the body fluids play a pivotal role in the diagnosis of various diseases. Therefore, it is important to accurately separate the required substances, and several techniques are developed to be used for this purpose.
We have developed a lab-on-a-disc type of device and platform named CD-PRIME. This device is automated and has good results for sample contamination and sample stability. Moreover, it has advantages of a good acquisition yield, a short operation time, and high reproducibility. In addition, depending on the type of disc to be mounted, plasma containing cell-free DNA, circulating tumor cells, peripheral blood mononuclear cells, or buffy coats can be separated. Thus, the acquisition of a variety of materials present in the body fluids can be done for a variety of downstream applications, including the study of omics.

This paper describes the application of automated equipment to easily and efficiently separate and collect substances, such as cell-free DNA and circulating tumor cells, from whole blood.

Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Medizin

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Immunologie und Infektion

An Efficient Method for Extracting Human Fallopian Tube Epithelia for Single-cell Analyses

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if fertilization is successful, the embryo. The epithelial cells that line the inner surface of fallopian tubes are integral to both normal and abnormal fallopian tube processes, including disease initiation. After menopause, fallopian tubes cease to have a significant role in the body and the intraepithelial cell makeup changes. We describe a method in which these epithelial cells can be isolated from fresh fallopian tubes with minimal stromal cell contamination into a single-cell suspension. These cells can be grown in culture or used for further analysis such as flow cytometry and single-cell RNA sequencing. This isolation protocol can be achieved in 4-6 h and yields viable cells that can be used for immediate downstream analysis. This efficient protocol facilitates the isolation of fallopian tube epithelial cells with an enriched epithelial population.

This protocol describes a one-day method for the isolation of human fallopian tube epithelial cells. Isolated epithelial cells can be plated in 2-dimensional (2D) culture or dissociated into single-cell suspensions and utilized in downstream experiments, including flow cytometry and single-cell RNA sequencing.

Eine effiziente Methode zur Extraktion von Epithelien aus menschlichen Eileitern für Einzelzellanalysen

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Flow Cytometric Analysis of Biomarkers for Detecting Human Sperm Functional Defects

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no abnormalities in conventional semen parameters. Additional technologies are needed to explain the idiopathic infertility and detect subtle sperm defects. Currently, biomarkers of sperm function, including sperm apoptosis, mitochondrial membrane potential (MMP), and DNA damage, reveal sperm physiology at the molecular level and are capable of predicting male fertility.
With flow cytometry (FCM) techniques, each of these markers can be rapidly, accurately, and precisely measured in human semen samples, but time costs substantially increase and results could be obstructed if all the biomarkers need to be tested with a single cytometer. In this protocol, after collection and immediate incubation at 37 &#176;C for liquefication, semen samples were further analyzed for sperm apoptosis using Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) staining. The MMP was labeled with 5,5&#8242;,6,6&#8242;-tetrachloro-1,1&#8242;,3,3&#8242;-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) probe, and DNA damage was assessed using the sperm chromatin structure assay (SCSA) with acridine orange (AO) staining. Thus, flow cytometric analysis of sperm function markers can be a practical and reliable toolkit for the diagnosis of infertility and evaluation of sperm function at both bench and bed.

The present protocol provides a practical solution that allows for the measurement of apoptosis, mitochondrial membrane potential, and DNA damage in human sperm with a single cytometer.

Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no ...