Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

1. Hücre Hasat <ol><li> Primer doku hasat hücrelerin Not: Primer doku hasat hücreleri için tarif edilen işlem, fare meme tümör dokusu için özel olarak uygulanabilir ve başka kaynaklardan, birincil dokular için uygulanabilir olmayabilir. <ol><li> 5 mg hiyaluronidaz ve doku gramı başına 10 ml DMEM / F12 ortamında 30 mg kolajenaz çözülmesiyle sindirim tamponu hazırlayın işlenecek. sindirim tampon sterilize filtre. </li><li> Fare ve kayıt tümör ağırlığından birincil meme bezi tümörü izole edin. </li><li> en az 5 dakika süreyle 10. neşter ile dokusunu inceltmek. </li><li> sindirim tamponu (doku gramı başına 10 ml tampon) uygun hacme kıyılmış doku ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1-3 saat boyunca 100 rpm&#39;de sindirim tamponu içinde kıyılmış doku çalkalayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine 0.4 um&#39;lik bir filtre boyunca hücrelerin geçirilerek tek bir hücre süspansiyonu elde edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleriC. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> Yeniden süspanse 4 ml DMEM / F12 içinde topak, 5 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe transfer. </li></ol></li><li> Doku kültüründen hasat hücrelerin <ol><li> Plakayı ya da oda sıcaklığında, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yapışık hücre şişesi. Not: hasat hücreleri için tarif edilen teknik, insan embriyonik kök hücre (HESC) kültürü hücrelerinin yapışık özellikle geçerlidir. Bununla birlikte, tarif edilen protokol kalan diğer kültürlenmiş hücre çizgileri, yapışkan olmayan hatları ve primer hücreler geniş çapta uygulanabilir. </li><li> yapışkan hücrelerden tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için optimize edilmiş bir ısıtılmış (37 ° C), tripsin ve diğer enzimatik sindirim reaktif ekleyin. Üreticinin protokolü takip edin. Not: tripsin ve diğer enzimatik ayrılma reaktif hücre işaretçileri etkileme potansiyeli vardır. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübasyona bırakılır2-5 dakika hücreleri ayırmak için ° C. yüksek confluency kültürler için, hafifçe hücreleri ayırmak yardımcı olmak için plakayı dokunun. </li><li> 5 mL&#39;lik yuvarlak tabanlı tüp içine levhadan tamamen müstakil hücreleri aktarın ve yavaşça hücreleri ayırmak için 1 ml pipet kullanılarak pipetleyin. Not: Tüm adımlar, alternatif olarak, bir 96 yuvalı yuvarlak tabanlı plaka içinde gerçekleştirilebilir örneklerin çok sayıda işlem için. 96 oyuklu bir formatta örneklerinin işlemden geçirilmesi için tüm yıkamalar 250 uL&#39;lik bir hacimde gerçekleştirilir. Toplam hacim 300 uL aşmayacak şekilde diğer adımlarda açıklanan miktarlar ayarlanabilir. </li><li> (PBS içinde% 0.5 BSA ve% 0.02 sodyum azit) eşit hacimde yıkama tamponu ile enzimatik sindirim reaksiyon ajanı söndürüldü. NOT: Sodyum azid tehlikeli kimyasaldır. Uygun güvenlik önlemleri kendi üretim ve taşıma bakımından uyulmalıdır. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> süspanse edin1 ml serumsuz ortamdaki hücreler. </li><li> bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. tripan mavisi ve bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sisteminde bilinen bir orana kısım seyreltin. </li></ol></li><li> S-faz nüfus Etiketleme NOT: S-fazı etiketleme olmayan gerçekleştirilecekse 1.4 kök devam edin. <ol><li> Her 2 x 10 6 hücre analiz edilmesi için serumsuz DMEM F12 veya diğer uygun ortam içinde 10 uM 5-İyodo-2&#39;-deoksiüridin, 1 mL (DUK) hazırlayın. </li><li> Her 2 x 10 6 hücre için serumsuz ortam içinde 10 uM Idu 500 uL ekleyin. Not: DUK etiketleme serum ihtiva eden ortam içinde yapılabilir olmakla birlikte, serbest protein, ölü hücrelerin uygun etiketleme önlenmesi, sisplatin ile reaksiyona girer. Serum içeren ortam etiketleme DUK sırasında kullanılan, ek bir yıkama aşaması serumsuz ortam sisplatin ölü / canlı sta öncesinde serum proteinleri uzaklaştırmak için gerekli olan biradencilik. </li><li> Yavaşça 1 mL pipet ile pelet yeniden süspanse edin. </li><li> hafif sallama ile 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol></li><li> Canlı / Ölü etiketleme <ol><li> Her bir örnek için serumsuz DMEM-F12 ya da hücre tipi, uygun ortam içinde 50 uM sisplatin 500 uL hazırlar. Not: DUK S-fazı nüfusun etiketleme değildir yapılacak ise, 4 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon örnekleri. sisplatin ekleyerek tekdüze canlı / ölü etiketleme için çözümlerin daha çabuk karışmasını sağlayan önce hücrelerin tekrar asılı. </li><li> Örnekler 2 x 10 6 hücre başına 50 uM sisplatin 500 uL ekleyin. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> İki kez yıkayın numuneleri500 uL yıkama tamponu ile aşırı sisplatin kaldırın. </li><li> İki kez 500 uL PBS ile yıkayın numuneler aşırı protein kaldırmak için. </li></ol></li><li> Numune sabitleme <ol><li> 500 ul PBS içerisinde yeniden süspanse örneği. </li><li> % 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için. Not: 6.9 arasında olan pH seviyesini ve 0.44 um filtre içinden geçmesi, toz,% 4 PFA taze hazırlayın. PBS içinde% 4 PFA, iki haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. genellikle ölçülen kütle kanallarında parazite yol açabileceği metal kirleticiler içerir olarak, özel olarak, test edilinceye ampuller verilen önceden yapılmış formalin, kaçının. PFA alt konsantrasyonu yeterli olduğu ve antikor bağlanması ile tespit etkisini en aza indirmek için yardım ancak ampirik olarak test edilmelidir olabilir. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle yüzer wi aspirethout topağına zarar. </li><li> PBS ile yıkayın örnekleri PFA çözüm kaldırın. NOT: Bu adımda numuneler 4 ° C&#39;de kısaca saklanabilir. 4 ° C&#39;de uzun süreli depolama örneğinin bozulmasına neden ve azaltılmış lekeleme olabilir. </li></ol></li></ol> 2. Barkodlama NOT: Monoizotopik sisplatin barkodlama ve paladyum barkod kullanan için metodoloji aynı anda sunulurken, ya bağımsız kullanılabilir veya deney için gerekli değilse tamamen kaçınılmalıdır. <ol><li> Monoizotopik Cisplatin Barkodlanması NOT: Canlı / Ölü boyama kanalları bakım örtüşen itimat sisplatin barkodlama ve sisplatin canlı hücrelerde bu arka plan sisplatin Canlı / Ölü boyanma sağlamak için alınması gereken bu yana sisplatin barkod doğruluğu engel olabilecek bu şekilde en aza indirilir. <ol><li> PBS içinde 200 uM ila 1 mM monoizotopik sisplatin stok çözeltileri ile seyreltilir. </li><li> e içinACH benzersiz sisplatin barkod bu barkod alan her 2 x 10 6 hücre için 500 ul PBS ile 1.5 ml tüp hazırlanır. </li><li> Her benzersiz barkod 200 nM nihai konsantrasyona geçerli her Monoizotopik sisplatin eklemek hazırlamak için. </li><li> 2 x 10 6 hücre başına 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Her bir örnek için, karşılık gelen barkod çözeltisinin eşit hacim. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri fazla sisplatin kaldırın. </li></ol></li><li> paladyum Barkodlama Not: Paladyum barkod reaktifleri, hazırlanan 5 ya da ticari olarak satın alınabilir. <ol><li> kısmi Geçicipermeabilization 19 NOT: reaktif hücre zarlarını geçmek ve sağlam hücre etiket için palladyum şelasyon barkod kısmi geçirgenliği gerektirir. <ol><li> 500 uL PBS ile yıkayın örnekler. </li><li> 500 uL PBS artı% 0.02 saponin ile yıkayın örnekler. </li><li> kalıntı hacme yeniden süspanse pelet. </li></ol></li><li> Paladyum barkodu sistemi. <ol><li> 1 ml buzla soğutulmuş PBS artı% 0.02 saponin paladyum barkod reaktifi 100x stokunu. </li><li> Hızla yeniden süspansiyon haline getirilmiş numune için seyreltilmiş barkod reaktifmi. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Hücre Yüzeyi Boyama NOT: Hücre yüzey boyama öncesinde tespit canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu thei için afinite kaybeder antikorlar için gerekli olabilirtespit sonrasında R epitopu. Bazı hücre numuneleri, örneğin arka planı azaltmak için önceki antikor etiketleme lökositlerin Fc engellenmesi gibi ek bloke yararlanabilir. Optimum bloke ampirik olarak belirli bir numune tipi için belirlenmelidir. <ol><li> Hücre yüzeyi antikor boyama paneli hazırlayın. <ol><li> 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre yüzeyi antikorun 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın. NOT: titrasyon deneyi ile empirik deney öncesinde her bir antikor için seyreltme çalışma belirler. </li><li> eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine Bölünmüş hücre yüzeyi antikor havuzu lekelenmesine. </li><li> Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tampon 500 ul hazırlayın. </li></ol></li><li> Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine Hücre yüzeyi lekelenmesi uygulayın. NOT: ens içinBirden fazla numune boyunca ure tutarlı Antikor etiketleme dikkatli bir numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için son derece önemlidir. Aşağıdaki adımlar, antikor ilave edildikten sonra son numune hacimleri tek biçimli olduğu sağlayarak bu kıvam elde etmek amacı. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> 50 uL 200 uL pipet seti ile, parçalara ayrılır, hücre yüzey antikoru havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer kalan çözelti çıkarın. </li><li> Pipet ucu içine hava çizmeden alikot tüp tüm sıvı kadar Pipet. </li><li> Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder. </li><li> örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon. </li><li> 1 için numune inkübesürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında h. </li><li> iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri tüm serbest antikor, yıkanıp emin olmak için. </li><li> 500 uL PBS ile yıkayın örnekler. </li><li> 500 ul PBS içinde hücre pelletini. </li><li> PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için. </li><li> bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li></ol> 4. hücre geçirgenliği ve hücre içi boyanması <ol><li> Hücre permeabilization <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> Pelet ayrışmış kadar yavaşça girdap oluşturarak kalıntı hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Not: MeOH birbirlerine yapışmasını hücreleri neden olur eklenmesi ve kısmen örnek kaybına neden olan bir ince film üretmek için önce hücreleri ayırmak için başarısızlık. </li><li> Hemen 1 ml, 2 x 10 6 100% MeOH ilave &lt;/ Sup&gt; hücreler ve karıştırmak için hafifçe pipet. Not: diğer geçirgenleştirilmesi yöntemleri MeOH ile ikame edilebilir ve bazı hücre tipleri için uygun geçirgenliği elde etmek için gerekli olabilir. hala tutarlı geçirgenliği sağlarken, bazı hücre kaynakları için bir% 0.1 Triton X-100, geçirgenliği için PBS çözeltisi içinde% 0.2 Tween-20 veya% 0.1 saponin, daha iyi bir hücre bütünlüğünü muhafaza edebilir. </li><li> geçirgenliği için 4 ° C&#39;de 24 saat, en fazla en az 1 saat süre ile veya en fazla inkübe edin. Not: MeOH örnekleri -80 ° C&#39;de en fazla 1 aya kadar saklanabilir Bu adımda. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> Her MeOH örnek permeabilize kullanılan ml yıkama tamponu 1 mL ekleyin. Yavaşça hücre pelletini. </li><li> 500 uL yıkama tamponu ile iki kez örnek yıkayın. </li></ol></li><li> Hücre içi antikoru boyama paneli hazırlayın. <ol><li>1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre içi antikoru 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın. </li><li> eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine hücre içi antikoru havuzu bölme. </li><li> Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tamponu 500 uL hazırlayın. </li></ol></li><li> Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine intraselüler boyama uygulayın. Not: dikkatle numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemli olan çok sayıda numune tutarlı antikor etiketleme sağlamak. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> 50 uL ayarlanmış 200 uL pipetle numunelere hücre yüzeyi antikor havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer çözeltisi kalan kaldır. </li><li> Pipetkadar alikot tüp içindeki sıvı tüm pipet içine hava çekmek olmadan. </li><li> Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava 50 uL bir toplam numune hacmi için yıkama tamponu hazırlanması, tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder. </li><li> örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için inkübe edin. </li><li> Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu. </li><li> 500 uL PBS ile yıkayın örnekler. </li></ol></li></ol> 5. İridyum Etiketleme <ol><li> Fix numuneleri <ol><li> 500 ul PBS içinde yeniden süspanse örnekleri. </li><li> PBS içinde% 4 PFA 500 uL ekleyin. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika içinde en az inkübe edin. </li></ol></li><li> DNA iridyum etiketleme uygulayın <ol><li&gt; 62.5 nM konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA içinde 125 uM 500x iridyum interkalasyon reaktifi seyreltin. </li><li> örnekler 500 uL 62.5 nM iridyum PFA solüsyonu ekleyin. NOT: overstaining önlemek için 2.000: permeabilize hücreleri kullanılarak deneyler için, bir son 1 seyreltme için 500x Ir191 / 193 stok seyreltin. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. Not: güçlü Ir193 sinyalleri Pt194 kütle kanala katkı olumsuz barkod kalitesini etkileyebilir çünkü monoizotopik sisplatin barkodu performans daha uzun, 15 dakika boyunca iridyum ile örnekleri inkübe yoksa. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> iki kez süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde 500 uL% 0.1 BSA ile yıkayın örnekler. NOT: Bir kere mümkünse biz 24 saat içinde numuneleri çalıştırmanızı öneririz hazırladı. Hazırlanan numuneler, 4 ° C&#39;de kısa süreli saklanabilirancak bakım bozulmasını önlemek için alınmalıdır. bu alet temizleme azalacaktır makinesinin püskürtme odası ve örnekleyici konileri birikimini azaltmak gibi son yıkama BSA&#39;sız süzülmüş deiyonize su içinde yapılmalıdır mümkünse. HESC için, BSA boru yüzeyine yapışmasını örnek kaybını önlemek için de dahil olmak üzere iken, bu yıkama işlemi gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 6. Acquisition&#39;ın Örnekleri hazırlayın <ol><li> hücre sayımı <ol><li> süzülmüş deiyonize su içinde 500 uL% 0.1 BSA içinde yeniden süspanse hücreleri ve 35 um hücre filtresi kapağı boyunca taze tüpe filtre. NOT: son yıkar için BSA seviyesini düşürmek Kitle sitometrisi püskürtücü kalıntısından azalır. Yapışmayan hücreler yıkanır ve süzülmüş deiyonize su içinde yeniden süspanse edilebilir. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. bilinen bir orana kısım seyreltintripan mavisi (hücre görselleştirme yardım etmek için) ve bir hemositometrede veya otomatik hücre sayımı sistemine aktarılır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li></ol></li><li> Hazırlama ve yük örnekleri <ol><li> Kalibrasyon boncuklar buzdolabından çıkarın ve yeniden süspansiyon haline getirilmesi şiddetle çalkalanır hazırlamak. </li><li> otomatik numune alıcı sitometri kütlesi kullanılarak örnekleri çalışan, daha sonra analiz edilecek olan arzu edilen hücre sayısını eklemek numune plakasının her oyuğuna kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 uL ekleyin. kılavuzu enjeksiyon ile çalışan örnekleri örneklemek için kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 mcL ise, süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde numunenin seyreltilmesi karıştırın ve Kütle sitometrisi örnek enjeksiyon portuna yük örneği. Uygun numune seyreltme analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişebilir, ancak, 10 6 bir seyreltme 1 genel olarak uygundur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization.">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li><li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry.">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li><li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li><li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry.">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry.">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li><li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival/proliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem/progenitor+cells.">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development.">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining.">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li><li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data.">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li><li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data.">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li><li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry.">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li><li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizaing+Data+using+t-SNE.">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry:+Measure+for+measure.">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li><li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+cytometry.">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li><li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-FISH:+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry.">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan protokol başarıyla çeşitli kültürlenmiş hücre çizgileri (H1 ve H9 HESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) ve birincil doku örnekleri (fare kemik iliği, fare embriyonik karaciğer, fare yetişkin işlenmesi için kullanılan edilmiştir karaciğer, fare tümör). Bağımsız kaynağı, hücre durumunu muhafaza sitometrisi kütle analizi için uygun olmalıdır, ancak bir protokol optimizasyon gerektirebilir ise tek hücre halinde ayrılabilir bir doku. Bazı epitoplar kullanılan spesifi...

Sitometri büyük hücre popülasyonları arasında, bir tek hücre düzeyinde birden, antikor hedefi ölçümünü sağlar. Geleneksel flüoresan bazlı akış sitometrisi olarak, ölçülebilir parametre sayısı parametreleri sayısı arttıkça daha karmaşık dengeleme hesaplamalar gerektirir birden florofor emisyon spektrumu arasındaki spektrum çakışmasının ile sınırlıdır. Bu kısıtlamalar, ağır metal-konjüge edilmiş antikorları tespit edilir ve büyük ölçüde eş zamanlı olarak toplanır parametre sayısını arttırmak ve her bir hücre için yüksek bir boyutsal protein bolluğu profilini elde etmek için bir uçuş (TOF) kütle spektrometresi zaman ile hesaplanır kütle sitometrisi tarafından ele alınmaktadır. enstrümanın sitometrisi kütlenin çalışmaları bir temel anlayış kullanıcıya faydalıdır ve sorun giderme için gerekli olabilir. Daha kapsamlı bir ayar açıklaması ve kitlesel sitometrisi makinesini çalıştıran için,ilgili el yazması 1 &#39;e bakınız. Kısaca, bir hücre numunesi, hücre yüzeyi markerleri sitoplazmik proteinleri, nükleer proteinler, kromatin bağlı proteinleri veya (Şekil 1i) &#39;in diğer epitopları hedefleyen metal konjuge bir antikor paneli ile etiketlenir. Sınıflandırılmış hücreler, bir otomatik numune alıcı ile makineye yüklenmiş, ya el ile enjeksiyon sureti ile bir zamanda bir ya da olduğu, 96 oyuklu bir plaka örnekler. Yüklü hücreler hücreler (Şekil 1ii) kapsül, sıvı damlacıkları spreyini üreten bir nebulizer aracılığıyla enjekte edilir. Hücreler, bir argon plazma lambasının iyonize böylece Bu sprey konumlandırılır. Bu iyonizasyon her bir hücre (Şekil 1iii) oluşturan bütün atomlardan müteşekkil bir partikül bulutu oluşturur. Bu partikül bulutu detektöre ettikçe, düşük atomik kütle atomu, bir dört kutuplu kütle filtre ile yüksek kütle iyonu ayrılır. Geri kalan, yüksek kütle iyonlarını dedektörü, abund devamHer bir izotopun formans (Şekil 1iv) ölçülür. detektör tarafından toplanan ham veriler, hücre olayları tanımlamak için kitle sitometrisi enstrüman yazılımı tarafından analiz edilir. Tanımlanan her bir hücre etkinliği için, her bir kanal tespit sinyali ölçülür ve bir çıkış .fcs dosyaya kaydedilir. ağır metal olarak birleştirilmiş antikorlarını tespit etmek için kullanılan seri kanal% 1&#39;in altında en katılım% 0-4 arasında değişmektedir az spektral örtüşme sergiler. Çünkü kanallar arasında bu düşük çapraz konuşma, analiz 2 önce bir telafi matris veri dönüştürmek için genel olarak gereksizdir. Ancak, bakım, bu gibi, bir yüksek bolluk epitopa sahip bir antikor, bir düşük miktardaki bir antikor atanmış bir kanala sinyali katkıda bulunan bir kütle kanalına tahsis emin olmak için antikorların deneysel panelinin tasarımı sırasında alınmalıdır sinyal katkı alıcı kanalın bir yapay yüksek nüfus oluşturmak. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; sitometri analizi kütle için numune kesin hazırlanması toplanan numunelerin tiplerine bağlıdır ve deney hipotezi test edilir. Bu farklı hücre tiplerini (insan embriyonik kök hücreler) ve birincil hücreler (fare meme tümörü epitel hücre izolatı) hasat etmek üzere iki protokol örneklerini temin etmektedir. Bir kitle sitometrisi Çalışmanın başlangıcında, her şeyden önce protokolleri ve antikorlar araştırmacının elinde iyi çalışıyoruz yararlanılacak sağlamak için küçük bir pilot deneyi yürütmek için tavsiye edilir. Özel konjüge antikorlar kullanılacak olan bu antikor, konjugasyon sırasında kısmi indirgeme reaksiyonu gibi antikor afinitesini bozmaya potansiyeline sahip, özellikle önemlidir; Bu nedenle, her bir özel antikorun veri doğruluğunu sağlamak için deneysel olarak doğrulanmış edilmesi gerekmektedir. bunlar ne ise hücre yüzeyi antikorları tespit sonrası epitoplarını tanıyacak tahlilinde kullanılabilir veya eğer diğer hususlar anlaşılması,ed hücrelerini canlı uygulanacak. Peptit-MHC 3, 4 boyanması ile oluştuğu bilinmektedir gibi bazı sabitleme hücre yüzeyi antikorlarıyla uygun boyama engelleyebilir. Canlı hücreler üzerinde hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirilmesi bazı antikorlar için gerekli olabilir, ama bu antikor bazlı barkod 6, 7, bir durum olduğu halde en çok barkod yöntemleri tespit 5 sonra gerçekleştirilir gibi antikor etiketleme önce barkod seçeneğine engeller olabilir. hücre sayısının belirlenmesi analizi için hazırlanacak olduğunda, makine üzerine yüklenen hücrelerin sadece bir kısmı tespit edilecek biliyoruz ve veri üretmek için önemlidir. nebülizör torçta örnek spreyler, bu kayıp verimsizliklere esas kaynaklanmaktadır. Kesin yüzde kaybı% 50-85 arasında olabilir makine kurulumu ve hücre tipi ama sitometrisi kütlesine bağlıdır ve olmalıdeney tasarımı düşündü. Bu protokol, numune başına 2x10 6 hücreleri için optimize edilmiş ama daha küçük ya da daha büyük örneklerin işlenmesi için uyarlanabilir. Bu protokol, ancak örnek sayısı, bir deney içinde tutarlı tutulması önemlidir, 4 x 10 6, 1 x 10 6 örnek boyutları için, en az modifikasyon ile kullanılabilir. Hücre sayısındaki değişimler barkod ve antikor boyama yoğunluğunu etkileyebilir ve numuneler doğrudan karşılaştırılmalarını mümkün boyunca yaklaşık tutarlı tutulmalıdır. tüm deneysel tasarımlar değilse böyle ölü hücre etiketleme ve DNA etiketleme gibi bazı uygulamalar ise, büyük çoğunluğunda yapılmalıdır. Sadece yüzey belirteçleri analiz eden deney ölü hücrelerin etiketlenmesi Rh103 kullanılarak elde edilebilir, ancak Rh103 bu boyama kaybına yol açtığı için geçirimli hale gereklidir deneyler için kaçınılmalıdır. geçirgenliği içeren deneyler için, sisplatin kullanılması tavsiye edilir <sSınıf = &quot;xref&quot;&gt; 8 ve yukarı mümkün olduğunda, yarık PARP ve klivaj Kaspaz tanıyan bir antikor apoptotik ve ölü hücrelerin tespit etmek. Çizgi örnekler, antikor tüketimini azaltmak etme süresini azaltmak ve ortadan kaldırabilen örnek-örnek değişkenlik 9. barkod süreci menşe örnek için her hücre atamak için kullanılan tüm hücreler, benzersiz bir numuneye özgü kod uygulanmasını içerir. örnekleri barkod sonra antikor boyaması, tüm örnekler eşit boyanmış sağlayan bir yönteme önce toplanmış olabilir. Deneysel hatayı en aza indirmek için, barkodun ihtiyatlı ve doğrudan birbirlerine karşılaştırılacak hiçbir örnekleri havuz. Şu anda (aşağıya bakınız) burada sunulmaktadır ikisi analizi 5, 6, 7, sitometrisi kitle için örnek barkod için çeşitli yöntemler de mevcuttur. şu anda mevcut Reagen ile38, antikor hedefi bolluğu ölçmek S-fazı 10 hücreleri tespit canlı ve ölü hücreler 8 ayırt ve çok sayıda numune bir çoğullamalı deneyde hipoksi 11 hücresel seviyelerinin ölçülmesi mümkündür ts. Büyük hücre popülasyonları için yüksek bir parametre, tek bir hücre veri toplamak için bu yeteneği yüksek ölçüde heterojen bir hücre popülasyonlarının iyileştirilmiş profil sağlar ve daha önce, yeni biyolojik anlayış, 12, 13, 14, 15, 16, bir dizi üretti. Yorumlanabilir bilgilere elde edilen kompleks veri Damıtma Kapsayan Ağaç Yoğunluk Normalize Olayların Gelişimi (maça) 17 ve vişne 18 de dahil olmak üzere bilgisayar algoritmaları kullanımını gerektirmiştir. Bu makale erişilebilir bir sunarnasıl genel tasarım ve deney sitometri bir kitle yürütmek ve veri sitometrisi kitlenin temel analizini tanıtır için.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble to 25&amp;nbsp;mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2&#039;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble to 74&amp;nbsp;mg/mL in 0.2&amp;nbsp;N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 intercelating agent</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Chill at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m filter cap tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ four element calibration beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass cytometry analysis

Kütle sitometrisi ağır metal etiketler, iyi sitometrisi geleneksel floresan bazlı akışıyla mümkün olanın ötesine parametreleri ve derin analiz için imkânlar artırılmıştır ölçüde olan bir yaklaşımla konjuge antikorları kullanır. Herhangi bir yeni teknoloji olduğu gibi, yüksek kaliteli veri güvenilir nesil sağlamaya yardımcı kritik adımlar vardır. kütle sitometri analizi için hücre örneklerinin işleme için birden çok teknikler içerir optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur. Burada anlatılan yöntemleri kullanıcı ortak tuzaklardan kaçınmak ve yanlış verilere yol açabilir değişkenliği, minimize ederek tutarlı sonuçlar elde yardımcı olacaktır. Deneysel tasarım bilgilendirmek için, protokol ve araştırılmaktadır sisteminin biyolojide yeni bulgular ortaya çıkarmada bu etkinliği açısından isteğe bağlı veya alternatif aşamalar arkasındaki mantık kaplıdır. Son olarak, temsilci veri teknikleri présente beklenen sonuçları göstermek için sunulmuşturBurada d.

Burada sunulan protokol geniş yalnızca küçük değişiklikler ile kültürlenen ve primer hücre örneklerinin çeşitli uygulanabilir. örneğin barkod veya hücre yüzeyi boyama gibi bazı elemanlar, gerekli olmadığında deney gereksinimlerine bağlı olarak, bir modüler şekilde gerçekleştirilebilir. bütünüyle Kullanılan bu protokol ölü hücre dışlama, S-fazı nüfus tanımlanması için etiketlenmiş ve 38 kadar, antikor hedefi ölçümü için boyanmış numunelerin...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K Görüntüleme.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Video: Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Biyomühendislik

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Gelişim Biyolojisi

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Tıp

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Fare Hücre Tiplerinde Düşük Girdili Metabolik Çalışmalar

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

Yazar Spotlight: Nadir Hematopoietik Kök Hücrelerin İlerleyen Metabolomik Analizi 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi