Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

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	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization.">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li><li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry.">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li><li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li><li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry.">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry.">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li><li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival/proliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem/progenitor+cells.">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development.">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining.">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li><li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data.">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li><li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data.">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li><li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry.">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li><li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizaing+Data+using+t-SNE.">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry:+Measure+for+measure.">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li><li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+cytometry.">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li><li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-FISH:+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry.">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès pour le traitement de diverses lignées cellulaires en culture (H1 et H9 CSEh, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) et des échantillons de tissus primaires (moelle osseuse de la souris, la souris foie embryonnaire, adultes de souris foie, une tumeur de la souris). Quelle que soit la source, tout tissu qui peut être dissociées en cellules individuelles tout en préservant l&#39;état cellulaire devrait être prête à l&#39;analyse par cytométrie de masse...

Cytometry permet la mesure simultanée de plusieurs cibles d&#39;anticorps au niveau de la cellule unique sur de grandes populations de cellules. En cytométrie de flux à base de fluorescence classique, le nombre de paramètres qui peuvent être quantifiés est limitée par le chevauchement spectral entre le spectre d&#39;émission de multiples fluorophores, ce qui nécessite des calculs de compensation de plus en plus complexes comme le nombre d&#39;augmentations de paramètres. Ces limitations sont traitées par cytométrie de masse, où les anticorps conjugués à métaux lourds sont détectés et quantifiés par le temps de la spectrométrie de masse de vol (TOF) d&#39;élargir considérablement le nombre de paramètres collectés en même temps et donner un profil de protéines d&#39;abondance dimensionnelle élevée pour chaque cellule individuelle. Une compréhension de base du fonctionnement de l&#39;instrument de cytométrie de masse est bénéfique pour l&#39;utilisateur et peut être essentielle pour le dépannage. Pour une description plus complète de mise au point et l&#39;exécution d&#39;une machine à cytométrie de masse,voir le manuscrit lié 1. En bref, un échantillon de cellules est marqué avec un panel d&#39;anticorps conjugués métalliques ciblant des marqueurs de surface cellulaire, des protéines cytoplasmiques, des protéines nucléaires, des protéines de la chromatine lié ou d&#39; autres epitopes d&#39;intérêt (figure 1i). Les cellules marquées sont chargés sur la machine, soit un à la fois par injection manuelle ou en utilisant un passeur d&#39;échantillons que les échantillons à partir d&#39;une plaque à 96 puits. Les cellules chargées sont injectés par l&#39; intermédiaire d&#39; un nébuliseur, qui génère une pulvérisation de gouttelettes de liquide d&#39; encapsulation des cellules (Figure 1ii). Cette pulvérisation est positionnée de telle sorte que les cellules sont ionisés par une torche à plasma d&#39;argon. Cette ionisation génère un nuage de particules comprenant tous les atomes constitutifs de chaque cellule (Figure 1iii). Comme ce nuage de particules se déplace vers le détecteur, les atomes de faible masse atomique sont séparés des ions de masse élevée par un filtre de masse quadripolaire. Les hauts ions de masse restants continuent au détecteur, où le abundance de chaque isotope est quantifiée (Figure 1IV). Les données brutes recueillies par le détecteur, sont analysés par le logiciel d&#39;instruments de cytométrie de masse pour identifier les événements cellulaires. Pour chaque événement de cellule identifiée, le signal détecté dans chaque canal est quantifié et enregistré dans le fichier de sortie. Les canaux de masse utilisés pour détecter les anticorps conjugués métal lourd présentent un recouvrement spectral minimal, qui varie de 0,4% avec la plupart des contributions inférieures à 1%. En raison de ce faible diaphonie entre les canaux, il est généralement nécessaire de transformer les données avec une matrice de compensation avant l&#39; analyse 2. Cependant, il faut prendre soin lors de la conception du panneau expérimental d&#39;anticorps pour assurer qu&#39;un anticorps avec un épitope de haute abondance n&#39;est pas affecté à un canal de masse qui contribue signal à un canal attribué à un anticorps à faible abondance, car cela pourrait créer une population artificiellement élevé dans le canal de réception de la contribution du signal. <p class = « jove_content »&gt; La préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de cytométrie de masse exacte dépend fortement des types d&#39;échantillons recueillis et mis à l&#39;essai l&#39;hypothèse expérimentale. Nous fournissons des exemples de deux protocoles de récolte différents types de cellules (cellules souches embryonnaires humaines) et les cellules primaires (isolat de cellules épithéliales de la tumeur du sein de la souris). Lorsque vous commencez une étude de cytométrie de masse, il est conseillé de procéder d&#39;abord à une petite expérience pilote pour faire en sorte que tous les protocoles et les anticorps à être utilisés fonctionnent bien entre les mains de l&#39;enquêteur. Ceci est particulièrement essentiel lorsque les anticorps conjugués sont personnalisés pour être utilisés, comme la réaction de réduction partielle au cours de la conjugaison d&#39;anticorps a le potentiel de perturber l&#39;affinité des anticorps; Par conséquent, chaque anticorps personnalisé doit être validée de manière empirique pour assurer l&#39;exactitude des données. D&#39;autres considérations comprennent la détermination si des anticorps de surface cellulaire à utiliser dans l&#39;essai reconnaîtra leurs épitopes après fixation ou si elles nited à appliquer à des cellules vivantes. Certains fixation peut empêcher la coloration appropriée avec des anticorps de surface cellulaire comme cela est connu pour se produire avec coloration peptide-CMH 3, 4. Exécution d&#39;une coloration d&#39;anticorps de surface cellulaire sur des cellules vivantes peut être nécessaire pour certains anticorps, mais cela exclut la possibilité de barcoding avant le marquage de l&#39; anticorps comme la plupart des méthodes de codes - barres sont effectuées après fixation 5 , bien que le code à barres à base d&#39; anticorps 6, 7 est une exception. Lors de la détermination du nombre de cellules devant être préparé pour l&#39;analyse, il est important de savoir que seule une fraction des cellules chargées sur la machine sera détecté et produire des données. Cette perte est principalement due à l&#39;inefficacité lorsque le nébulisateur pulvérise l&#39;échantillon à la torche. La perte exacte pour cent dépend de la masse configuration de la machine cytométrie et le type cellulaire, mais peut varier 50-85% et devrait êtreconsidéré lors de la conception de l&#39;expérience. Ce protocole a été optimisé pour 2x10 6 cellules par échantillon , mais peut être adapté pour le traitement des petites ou plus grandes tailles d&#39;échantillon. Ce protocole peut être utilisé avec des modifications minimes pour la taille des échantillons de 1 x 10 6 4 x 10 6, mais il est essentiel que la taille de l&#39; échantillon soit maintenu au sein d&#39; une expérience cohérente. Les modifications du nombre de cellules peuvent affecter l&#39;intensité de la coloration des anticorps et Code à barres et doivent être conservés à peu près cohérente à travers à être directement comparés échantillons. Certaines procédures, telles que l&#39;étiquetage des cellules mortes et l&#39;étiquetage de l&#39;ADN, doivent être effectuées dans la grande majorité, sinon tous les modèles expérimentaux. Le marquage des cellules mortes dans des expériences analysant uniquement les marqueurs de surface peut être réalisée à l&#39;aide Rh103, mais Rh103 doit être évitée pour des expériences où perméabilisation est nécessaire, car il entraîne une perte de coloration. Pour les expériences impliquant perméabilisation, il est conseillé d&#39;utiliser le cisplatine Code - barres échantillons peuvent réduire la consommation d&#39;anticorps, diminuer le temps d&#39;acquisition et d&#39; éliminer la variabilité échantillon à échantillon 9. Le procédé de codage à barres consiste à appliquer un code unique spécifique à l&#39;échantillon à toutes les cellules, ce qui permet d&#39;affecter chaque cellule à son échantillon d&#39;origine. Après barcoding les échantillons peuvent être mis en commun avant la coloration d&#39;anticorps, un processus qui assure que tous les échantillons sont colorés de manière égale. Pour minimiser l&#39;erreur expérimentale, il est prudent de code à barres et des échantillons piscine qui doivent être directement comparés les uns aux autres. À l&#39; heure actuelle , il existe plusieurs méthodes pour les échantillons barcoding pour l&#39; analyse de cytométrie de masse 5, 6, 7, dont deux sont présentées ici (voir ci - dessous). Avec Reagen actuellement disponiblets , il est possible de quantifier l&#39;abondance de 38 cibles d&#39;anticorps, identifier des cellules en phase S 10, distinguer les cellules vivantes et mortes 8 et de mesurer les niveaux cellulaires de 11 l&#39; hypoxie dans une expérience multiplexé d&#39;échantillons multiples. Cette capacité à recueillir des données sur une seule cellule de haute paramètres pour les grandes populations de cellules permet une amélioration du profil des populations de cellules très hétérogènes et a déjà produit un certain nombre de nouvelles connaissances biologiques 12, 13, 14, 15, 16. Les données complexes distillant résultant des informations interprétable a nécessité l&#39;utilisation d&#39;algorithmes de calcul , y compris Spanning Tree Progression de la densité des événements Normalisé (SPADE) 17 et 18 Visne. Cet article présente un accèsaperçu de la façon de concevoir et de réaliser une masse cytométrie expérience et présente une analyse de base de données de cytométrie de masse.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble to 25&amp;nbsp;mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2&#039;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble to 74&amp;nbsp;mg/mL in 0.2&amp;nbsp;N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 intercelating agent</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Chill at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m filter cap tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ four element calibration beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass cytometry analysis

Masse utilise cytométrie anticorps conjugués avec des étiquettes de métaux lourds, une approche qui a considérablement augmenté le nombre de paramètres et les possibilités d&#39;une analyse approfondie bien au-delà de ce qui est possible avec la cytométrie de flux par fluorescence conventionnelle. Comme pour toute nouvelle technologie, il y a des étapes essentielles qui contribuent à assurer la production fiable de données de haute qualité. Présenté ici est un protocole optimisé qui intègre plusieurs techniques pour le traitement des échantillons de cellules pour l&#39;analyse de cytométrie de masse. Les méthodes décrites ici aideront l&#39;utilisateur à éviter les pièges courants et obtenir des résultats cohérents en réduisant au minimum la variabilité, qui peut conduire à des données inexactes. Pour éclairer la conception expérimentale, la raison d&#39;être des étapes facultatives ou alternatives dans le protocole et leur efficacité dans la découverte de nouvelles découvertes dans la biologie du système étudié est couvert. Enfin, des données représentatives sont présentées pour illustrer les résultats attendus des techniques presented ici.

Le protocole présenté ici peut être largement appliquée à une grande variété d&#39;échantillons de cellules en culture et primaire avec seulement quelques modifications mineures. En fonction des besoins de l&#39;expérience, elle peut être réalisée de manière modulaire lorsque certains éléments, tels que la coloration surface cellulaire ou le codage à barres, ne sont pas nécessaires. Utilisé dans son intégralité ce protocole permet la préparation de la masse multiplex...

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Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse Cytométrie

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K vues.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Recherche

Bio-ingénierie

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Biologie du développement

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Médecine

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Immunologie et infection

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Études métaboliques à faible apport chez les types de cellules de souris

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser l’analyse métabolomique des cellules souches hématopoïétiques rares 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

Immunophénotypage et tri cellulaire des MKs humains provenant de sources primaires humaines ou différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques

Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse Cytométrie

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Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Métabolomique ciblée sur les cellules primaires rares

Immunophénotypage et tri cellulaire des MKs humains provenant de sources primaires humaines ou différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques