Name: surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

HINWEIS: Einige Schritte des Protokolls erfordern unter Arbeiten in einem sauberen Abzug. Außerdem erfordert das Verfahren eine Hefe Tetrade Präpariermikroskop mit einem 10X großen Arbeitsabstand Ziel ausgestattet Spheroplasting überwachen. Das Mikroskop sollte in der Haube vor der Zeit eingestellt werden. Entfernen Sie den Mikromanipulator Arm und Plattenhalter aus dem Anwendungsbereich und setzen diese Elemente in einem sicheren Ort weg vom Arbeitsbereich. 1. Herstellung von Sphäroplasten <ol><li> Wachsen Hefe unter gewünschten Bedingungen. Gebrauch über 2 x 10 8 Zellen für jede Probe, beispielsweise 4 ml einer Kultur bei 1,4 OD600 = 5 x 10 7 Zellen / ml. Obwohl sofortige Verarbeitung von Proben kann in einigen Fällen bevorzugt sein, für die meisten Anwendungen, Zell Aliquots auf Eis für bis zu 8 Stunden vor der Verarbeitung gelagert werden. </li><li> Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Spin in einer klinischen Zentrifuge bei Einstellung 5 (2345 rpm / 857,5 × g) für 3 min, um die Zellen zu pelletieren. </li&gt; <li> Dekantieren Sie das Medium dabei nicht zu Zellen aus dem Pellet zu verlieren. Vorsichtig resuspendieren Zellen in 1 ml Puffer ZK und fügen Sie 40 ul 1 M Dithiothreitol (DTT). Inkubieren Sie 2 min unter leichtem Mischen. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). </li><li> Resuspendieren Pellets in 1 ml Puffer ZK. Werden 5 ul einer frisch hergestellten Lösung von Zymolyase 100T, die gründlich gemischt wurde. Inkubieren für 20-30 min bei 30 ° C, um die Zellwand zu entfernen und Sphäroplasten. </li><li> Assay Eine 10 ul Tropfen der Zellsuspension auf einen Objektträger zu bestimmen, ob Spheroplasting abgeschlossen ist. Zellen unter dem Dissektionsmikroskop ohne Deckglas betrachtet. Die Zellen sind aufgedunsen und runde anstatt etwas länglich erscheinen und sollte nach der Zugabe von 20 &amp; mgr; l Wasser zu lysieren. Wenn Zellen nicht zur Lyse, Rückkehr der Probe auf 30 ° C und re-Assay alle 10 Minuten, bis das Wasser induzierte Lyse leicht zu beobachten ist. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). </li><li> Vorsichtig resuspendieren und waschen Zellpellet in 2,5 ml kaltem MES / Sorbit-Puffer. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). Vorsichtig resuspendieren Zellpellet in 300 bis 400 &amp; mgr; l kaltem MES / Sorbit-Puffer. Zellen auf Eis in dieser Phase für mehrere Stunden gehalten werden. </li></ol> 2. Chromosome Verbreitung HINWEIS: Die Glasflächen, auf denen Chromosomen verteilt, entweder werden Folien oder Deck-sollte vor der Zeit vorbereitet werden. Jeder Objektträger oder Deckglas sollte in Wasser getaucht werden, dann EtOH, dann trocknen gelassen, und poliert mit Objektiv Papier. Wenn Chromosomen auf Deckgläsern verteilt werden, sollte das Deckglas auf einem Objektträger mit Scotch Klebeband oder Gummizement befestigt werden. Soweit nicht anders erwähnt, wird der Rest des Protokolls beschreiben Ausbreitung entweder auf einem Objektträger oder Deckglas <ol><li> Verwendung einer P20-Pipette Pipette 20 ul Zellsuspension auf die Oberfläche einer sauberen Folie. </li><li> Verwendung eines P200 Pipette 40 ul 3% PFA / Saccharose-Lösung und vorsichtig mischen die solution durch &quot;wirbelnden&quot; die Folie mit der Hand, bis Schlieren Linien verschwinden. Den Objektträger unter dem Mikroskop, und bestätigen Sie, dass Zellen im Fokus. Die PFA-Lösung sollte im Abzug am Tag der Verwendung frisch zubereitet. Hinweis: Wenn das Protein von Interesse wurde durch das Verfahren nicht zuvor geprüft worden sind, ist es ratsam, zusätzliche Folien unter Verwendung von Lösungen, die 2 bis 4% PFA enthalten, um festzustellen, ob Retention des Proteins ist empfindlich gegen Fixierbedingungen vorzubereiten. A 4% PFA / Saccharose-Lösung wird in Fällen, in denen es wünschenswert ist, assoziiert Tubulin Mikrotubuli Visualisierung verwendet. Der Nachteil der höheren Fixiermittel Konzentration, dass die Chromosomen werden &quot;underspread&quot;, 2% PFA neigt auch dazu, &quot;underspread&quot; Chromosomen zu ergeben. </li><li> Verwendung eines P200 Pipette 80 ul 1% LIPSOL, wirbeln wie zuvor, um Lösungen möglichst vollständig zu mischen, starten Sie einen Timer. Wenn LIPSOL nicht verfügbar ist, können 80 &amp; mgr; l 1% NP40 oder 80 &amp; mgr; l dH 2 O werdensubstituierten (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2). </li><li> Beobachten Sie die Zellen vorsichtig und sanft wirbeln den Schiebe alle 15 sec. Bei etwa 80% der Zellen lysiert (verschwunden) stoppen Sie den Timer, ziehen Sie sofort den Schlitten aus dem Mikroskop, fügen Sie 80 ul PFA / Saccharose-Lösung, und Schwenken vermischen. Lyse sollte aus zwischen 30 und 90 sec nach dem Start des Zeitgebers auftreten. HINWEIS: Wenn mehrere Folien zeigen Lyse etwa zur gleichen Zeit, kann man schließlich mikroskopische Beobachtung für den Rest der Folien weglassen und einfach nur vorsichtig Mal, wenn die Zeit zwischen Zugabe von LIPSOL und Zugabe der letzten Aliquot Fixiermittel. Allerdings ist diese Abkürzung nur zuverlässig bei der Herstellung mehrere Folien aus der gleichen Probe. Am besten ist es, um die Lyse von jeder Probe mikroskopisch zu überwachen, wenn verschiedene Folien werden aus Proben zu verschiedenen Zeiten aufgenommen oder aus verschiedenen Kulturen vorbereitet. </li><li> Legen Sie die Folie auf eine ebene Fläche und die Ausbreitung der Flüssigkeit über die gesamte unfrosted surface des Schiebers mit der Seite eines sauberen Einwegpipette Weide unterhalb des Meniskus des &quot;puddle&quot;, aber über der Oberfläche der Folie selbst, dh statt. nicht &quot;Rake&quot; der Oberfläche des Objektträgers mit der Pipette. Pipette auf verschiedenen Folien nicht wiederverwenden, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie die Objektträger über Nacht im Abzug trocknen. Unlöslichen Kernkomponenten wird auf die Gleitfläche zu regeln und zu binden. Für große Experimente, ist die Planung der Nutzung des Weltraums für die Trocknungsstufe wichtig. </li><li> Einmal getrocknet werden optimale Resultate erzielt, indem der in die Immunfärbung Stufe am gleichen Tag erhalten. Das getrocknete Saccharose-Lösung bettet jedoch die Ausbreitung Chromosomen in einer &quot;Honig&quot;, das Einfrieren von Proben erlaubt: Folien können auf eine Kunststoffschieber-Box überführt und bei -20 ° C über Jahre gelagert werden. </li></ol> 3. Immunfärbung <ol><li> Dip Slides in 0,2% Foto-Flo 30 Sek. um Honig zu entfernen. Lean gleitet aufeine Kante, wobei die Kante auf einem Papiertuch ruht, um restliche Photo-Flo entfernen. </li><li> Dip Slides in 1x TBS für 5 min waschen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch gelehnt gleitet auf einer Kante, aber sie nicht austrocknen lassen. </li><li> Legen Sie Folien mattiert Seite nach oben, Pipette 300 ul TBS / BSA auf den Objektträger über die unfrosted Teil der Folie. </li><li> Inkubieren in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 15 min. (Große Plastikbehälter mit Wasser gesättigt Papierhandtücher unter einem Lochblech oder Kunststoffschieber Feld gesäumt von gesättigten Papierhandtücher). </li><li> Ablassen gleitet durch eine kurze Ruhe Rand des Objektträgers auf einem Papiertuch und lehnte den Schieber gegen einen geeigneten Träger (zB einem Reagenzglas Rack). Erlauben keine Oberfläche zu trocknen. </li><li> 80 ul TBS / BSA-Puffer, der die entsprechende Verdünnung des primären Antikörpers unmittelbar gelten. Wenn Antikörper Begrenzung, verwenden 40 ul und einem 22 x 22 mm Deckglas. Für grobe Kaninchenserum, das ist in der Regel zwischen einem und 1/50 1/500 Verdünnung. HINWEIS:Führen Titrationen für neue Antikörperpräparate. Die verdünnte Präparat, das High-Signal über dem Hintergrund ergibt gewählt wird. Um das Niveau der Hintergrundfärbung zu kontrollieren, sollte Kerne aus dem entsprechenden Deletionsmutante Stamm und / oder doppelte Trägern hergestellt sollte mit Präimmunserum gefärbt werden. </li><li> Legen Sie eine polierte 22 x 50 mm Deckglas auf der Folie zu vermeiden Blasen. Tun Sie dies, indem Sie die Deckglas zwischen dem Daumen und Zeigefinger an der langen Kante an Positionen in der Nähe von einem der kurzen Kante. Halten des Deckplättchens in einem 30 ° Winkel relativ zu gleiten, die kurze Kante der am weitesten von den Fingern wird abgesenkt, bis sie auf der Folie gerade innerhalb der Kante des &quot;puddle&quot; in der Nähe des bereiften Bereich des Schiebers ruht. Anschließend langsam das Deckglas in einer fließenden Bewegung, bis die Finger, die die Folie berühren die Bank, und dann los. Versuchen Sie nicht, die Position des Deckglases einzustellen, sobald sie landet. HINWEIS: Wenn Chromosomenspreads wurden vorbereitetklebten Deckgläser (anstatt direkt auf der Oberfläche der Folien), wird diese Probe Deckglas auf dem Objektträger in den Färbe- und Waschschritte fixiert zu bleiben. Eine zusätzliche Deck wird auf der Oberseite des Deckglases Probe gleichmäßig zu verteilen, der Antikörperlösung während der Färbung und anschließend verworfen platziert werden. </li><li> Die Objektträger in einer feuchten Kammer abgedichtet und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Halten Sie die mattierte Rand Die Objektträger in einen Objektträger Färbebank und tauchen in Küvette enthält TBS. </li><li> Tauchen Sie vorsichtig die Folie nach oben und unten, um das Deckglas zu entfernen. Versuchen, nicht zu viel Kraft zu verwenden, um dies zu tun. Waschen Sie die Objektträger 2x 10 Minuten durch Eintauchen in TBS. Objektträger aus Rack und Drain überschüssige Flüssigkeit durch Berührung Kante zu Papiertuch. Lassen Sie nicht die Oberfläche trocken. </li><li> Arbeiten unter gedämpftem Licht, sofort hinzufügen 80 ul TBS / BSA, das eine 1/1000-fachen Verdünnung von Fluorochrom konjugierten Sekundärantikörper (oder 40 &amp; mgr; l mit einer 22 x 22 mm Deckglas). Anzeiged Deck wie zuvor, und Inkubieren bei 4 ° C für 2 Stunden in der feuchten Kammer im Dunkeln. </li><li> Deckgläser zu entfernen, wie zuvor, abtropfen Folien und ermöglichen Oberfläche an der Luft trocknen für 1 bis 2 Stunden in der Dunkelheit. Lean Folien auf Papierhandtüchern wie zuvor. HINWEIS: Wenn die Verbreitung auf einem Deckglas montiert geführt wird, nehmen Sie das Deckglas aus der Folie vor dem Trocknen. Deckgläser werden dann wie für Dias in dem vorherigen Schritt beschrieben getrocknet. </li><li> Arbeiten unter gedämpftem Licht, fügen Sie etwa 30 &amp; mgr; l Medium, das Montage DAPI (drei 10 ul Tröpfchen) und dann vorsichtig senken Deckglas auflegen. Wenn die Spreads auf Deckgläsern, legen Sie die Tropfen Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger und Deckglas, Chromosom Seite nach unten auf die Folie. </li><li> Noch unter gedämpftem Licht, warten Sie 2 Minuten für Deck sich niederzulassen und zu versiegeln Kanten der Deckglas mit klarem Nagellack. Die Objektträger in eine flache Schiebeschachtel. HINWEIS: Bei der STED-Mikroskopie, Halterung mit ProLong Gold. Verwenden Sie 30 ul ProLong Gold-ohne DAPI und über Nacht heilen. Abdichtung mit Nagellack ist nicht notwendig. </li><li> Blick gleitet von Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 40 oder 100x Objektiv mit einem Filtersatz passend für DAPI zu konzentrieren. Gegebenenfalls Speicherung des Objektträgers in der Dunkelheit bei 4 ° C für mehrere Wochen. Nicht einfrieren. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bietet viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der biologischen Prozesse, einschließlich der Untersuchung von Proteinen, die Chromosom-Funktion steuern. Zwar gibt es die bekannten Vorteile von Bäckerhefe für genetische, molekularen und biochemischen Studien wird zytologische Untersuchungen der Verteilung der Proteine ​​in den Zellkern durch seine geringe Größe kompliziert. Die typische Hefenukleus hat einen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer, die nur etwa das 5fache der Auflösungsgrenze des sichtbaren Lichts ist. Somit wird die Menge von Informationen über die Verteilung von Kernproteinen, die von herkömmlichen Immunfärbung oder durch Verwendung von fluoreszierenden Protein-Tags, wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP) erhalten werden können, ist begrenzt. Ein nützlicher Ansatz zur Charakterisierung der subnuclear Verteilung von Proteinen ist Chromosom Oberfläche ausbreitet. Dieser Ansatz beinhaltet die Entfernung der Zellwand, stören und Zellkernmembranen und einellowing Die unlöslichen Bestandteile des Kerns, um auf die Oberfläche eines Objektträgers zu regeln. Diese unlöslichen Bestandteile sind die Kernmatrix und die Chromosomen. Darüber hinaus ermöglicht die Entfernung der löslichen Kerninhalte, die die Fähigkeit zur Chromatin gebundene Proteine ​​erkennen erhöht, das Chromosom Spreizverfahren zu einer wesentlichen Dekompression von Chromosomen, so dass die Ausbreitung Kernen haben einen Durchmesser von etwa 3 bis 5 um (z diploiden meiotischen Kerne) und 2 bis 3 um für diploide mitotischen Kernen. Diese Dekompression ermöglicht den Nachweis von Kernstruktur, die relativ schwierig oder unmöglich, in intakten Zellkernen zu beheben ist. Ein offensichtlicher Nachteil auf Chromosom Verbreitung ist die Möglichkeit, dass die Ausbreitung Verfahren kann teilweise oder vollständig die Struktur von Interesse stören. Von besonderem Interesse ist, dass einem bestimmten Chromosom gebundene Protein wurde, infolge des Streuverfahren verloren. Diese mögliche Komplikation should bei der Interpretation Daten gehalten werden. Ein Beispiel eines Proteins, das empfindlich auf den Spreizvorgang ist beta-Tubulin. Unter bestimmten Bedingungen kann sich die Spindel, die im Wesentlichen von Tubulin umfaßte, wird beim Aufspreizen 3 erhalten. Visualisierung der Spindel ist oft nützlich, um Kerne von Interesse Stufe. , Visualisierung Tubulin erfordert jedoch eine Behandlung mit einer hohen Konzentration Haarfestiger; Spindeln sind unter den nachstehend beschriebenen Standardbedingungen verloren. Dieses Beispiel zeigt, dass bei der Analyse der Verteilung von einem zuvor nicht charakterisiertes Protein, ist es wichtig, die Konzentration an Fixiermittel, um zu bestimmen, wie empfindlich das Protein an eine solche Variation variieren. Trotz der Bedenken in Bezug auf die Auswirkungen der Verbreitung Bedingungen auf Chromosomenstruktur hat die Nützlichkeit und Leistung des Verteilungsmethode in vielen Zusammenhängen gezeigt und hat breite Anwendung in der mitotischen und Charakterisierung, insbesondere meiotischen Zellen 4-7. Two Verbreitung Methoden ausgiebig genutzt. Die erste dieser Methoden, die von Dresser and Giroux 8 entwickelt, vermeidet die Verwendung von Reinigungsmittel und Verbreitung Zubereitungen, die relativ gut erhaltene Chromosomen-Morphologie, wenn für die DNA-spezifische Farbstoff DAPI gefärbt zu haben scheinen zu ergeben. Allerdings ist dieses Verfahren relativ schwierig zu vervollkommnen und die Qualität der Ausbreitung Kerne variiert stark, wenn eine Region eines Schiebers zu anderen Regionen verglichen. Dieses Problem kann man quantitative Ansätze, die die Abbildung viele nicht ausgewählten Kerne von einer Folie zur Datenerfassung Verzerrungen zu vermeiden beinhalten erschweren. Die zweite Chromosomenverteilungsmethode, die von Loidl und Klein 1 entwickelt, beinhaltet Ausgleichs Fixierung durch Paraformaldehyd, mit Lyse und Chromatin Dekompression durch eine Reinigungslösung gefördert. Wenn sie richtig durchgeführt wird, gibt diese Methode sehr reproduzierbare Ergebnisse mit weniger Region zu Region Variation im Vergleich zum Dresser and Giroux Verfahren. Diese Präsentation konzentriert sich auf eine Modified Version des Verfahrens von Loidl und Klein, wegen ihrer Zuverlässigkeit und Einfachheit. Chromosom Verbreitung ist nicht kompliziert oder zeitraubende; bis zu 100 Objektträger für Immunfärbung an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus können die Ausbreitung Vorbereitungen in der Tiefkühltruhe für die Jahre vor Immunfärbung gespeichert werden und damit Labore können ein Repository von gefrorenem Chromosomen-Spreads, die verwendet werden können, wenn neue biologische Fragen stellen oder neue Nachweisreagenzien zur Verfügung zu entwickeln. Das Chromosom verbreiten Verfahren wird am häufigsten in Kombination mit Immunfärbung und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, aber es ist auch möglich, Objektträger für die Super-Resolution-lichtmikroskopische Methoden wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie vorzubereiten.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

Das Aussehen der Ausbreitung Kerne kritisch, hängt von der Balance zwischen Chromosom Fixierung und de-Verdichtung. Selbst wenn die Reagenzien korrekt ausgeglichen werden, kann die Variation in dem Grad der Chromosom de Verdichten in den verschiedenen Regionen der gleichen Folie und / oder zwischen verschiedenen Folien auftreten. Somit sollte die Qualität der Aufstriche in einer bestimmten Region eines Schiebers beurteilt werden, bevor Bilder interpretiert werden. Die Wirkungen der &quot;?...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Oberfläche Verbreitung und Immunfärbung von Hefechromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Aufrufe.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Serie: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Forschung

Genetik

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biologie

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochemie

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Immunologie und Infektion

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...