Name: surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOTA: Alguns passos do protocolo a seguir exigem a trabalhar em um exaustor limpa. Além disso, o método requer um microscópio de dissecção de levedura tétrade equipado com uma objectiva 10X de longa distância de trabalho para monitorizar spheroplasting. O microscópio deve ser configurada na capa antes do tempo. Retire o braço micromanipulador e suporte da placa do âmbito de aplicação e colocar esses itens em um local seguro longe da área de trabalho. 1. Preparação de Esferoplastos <ol><li> Levedura crescer sob condições desejadas. Use cerca de 2 x 10 8 células para cada amostra, por exemplo, 4 ml de uma cultura em OD600 1,4 = 5 x 10 7 células / ml. Embora o processamento imediato de amostras pode ser preferível em alguns casos, para a maioria das aplicações, alíquotas de células pode ser armazenada em gelo durante até 8 horas antes de ser processado. </li><li> Transferir suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugação numa centrífuga clínica na posição 5 (2345 rpm / 857,5 xg) durante 3 min para sedimentar as células. </li&gt; <li> Decantar o meio tomando cuidado para não perder as células do sedimento. Suavemente ressuspender as células em 1 ml de tampão ZK e, em seguida, adicionar 40 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT). Incubar 2 min com mistura suave. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). </li><li> Suspenda as pelotas em tampão ZK 1 ml. Adicionam-se 5 ul de uma solução preparada de fresco de 100T zimoliase que tenha sido cuidadosamente misturado. Incubar durante 20-30 min a 30 ° C para remover a parede celular e produzir esferoplastos. </li><li> Dosear uma gota de 10 ul de suspensão de células numa lâmina de microscópio para determinar se spheroplasting é completa. Células vistos sob o microscópio de dissecação, sem uma lamela. As células devem aparecer inchado e volta em vez de ligeiramente oblonga e deve lisar após a adição de 20 l de água. Se as células não conseguem lisar, devolver a amostra a 30 ° C e re-ensaio a cada 10 minutos até que a água de lise induzida é facilmente observado. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). </li><li> Volte a suspender suavemente e lavar pellet celular in 2,5 ml MES / tampão sorbitol frio. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). Delicadamente ressuspender pellet celular em 300-400 ul frio MES / tampão sorbitol. As células podem ser mantidas em gelo, nesta fase, por várias horas. </li></ol> 2. Chromosome Espalhando NOTA: As superfícies de vidro sobre o qual os cromossomos serão distribuídos-quer slides ou lamelas-deve ser preparado antes do tempo. Cada um dos slides ou lamela deve ser submerso em água, seguida de EtOH, depois deixou-se secar, e polido com papel para lentes. Se cromossomos serão distribuídos em lamelas, a lamela deve ser afixada a um slide com fita adesiva ou cimento de borracha. A menos que indicado de outra forma, o restante do protocolo irá descrever espalhamento de cada um slide ou lamela <ol><li> Usando um pipetador P20, pipeta 20 ul de suspensão de células sobre a superfície de uma lâmina limpa. </li><li> Usando uma pipeta P200, adicionar 40 ul da PFA / solução de sacarose 3% e misture delicadamente o solution por &quot;rodar&quot; o slide com a mão até que as linhas Schlieren desaparecer. Coloque a corrediça sob o microscópio e confirmar que as células estão em foco. A solução PFA deve ser recém-preparado no exaustor de fumos no dia da utilização. NOTA: Se a proteína de interesse não foi examinado pelo método anteriormente, é aconselhável preparar lâminas adicionais utilizando soluções que contêm 2 e 4% PFA para determinar se a retenção da proteína é sensível às condições de fixação. Uma solução / sacarose PFA a 4% é utilizado nos casos em que é desejável para visualizar microtúbulos tubulina associados. A desvantagem do fixador concentração mais elevada é que os cromossomas será &quot;underspread&quot;, 2% de PFA também tende a produzir cromossomas &quot;underspread&quot;. </li><li> Usando uma pipeta P200, adicionar 80 ul de 1% LIPSOL, redemoinho como antes para misturar soluções tão completamente quanto possível, iniciar um temporizador. Se LIPSOL não está disponível, 80 ul de 1% NP40, ou 80 ul de dH2O pode sersubstituído (ver resultados representativos, Figura 2). </li><li> Assista as células com cuidado e agite gentilmente o slide a cada 15 segundos. Quando cerca de 80% das células foram lisadas (desaparecido) parar o temporizador, retire imediatamente a lâmina do microscópio, adicionar 80 ul de PFA / solução de sacarose, e agite para misturar. A lise deve ocorrer a partir de entre 30 e 90 segundos após o início do temporizador. NOTA: Se várias lâminas mostram lise em aproximadamente o mesmo tempo, pode-se omitir eventualmente monitorização de microscópio, para o restante das lâminas e simplesmente cuidadosamente o tempo entre o período de adição de LIPSOL e adição da aliquota final do fixador. No entanto, este atalho só é confiável quando se prepara vários slides a partir da mesma amostra. É melhor controlar a lise de cada amostra quando microscopicamente diferentes lâminas são preparadas a partir de amostras tomadas a diferentes tempos ou de diferentes culturas. </li><li> Coloque o slide em uma superfície plana e limpa e espalhar o líquido em todo o surfac unfrostede da lâmina utilizando o lado de um limpa, pipeta descartável Pasto mantido abaixo do menisco de &quot;poça&quot;, mas acima da superfície da própria corrediça, isto é. não &quot;acumular&quot; a superfície da lâmina com a pipeta. Não reutilize pipeta em slides diferentes para evitar a contaminação das amostras. </li><li> Deixe os slides para secar durante a noite na capela. Componentes nucleares insolúveis vai resolver sobre a superfície da lâmina e se ligar a ele. Para grandes experimentos, o planejamento do uso do espaço para a etapa de secagem é importante. </li><li> Uma vez secos, os melhores resultados são obtidos por progredir para a fase de imunocoloração no mesmo dia. No entanto, a solução de sacarose a seco incorpora os cromossomas espalhados numa &quot;mel&quot; que permite a congelação de amostras: As lâminas podem ser transferidos para uma caixa de corrediça de plástico e armazenado a -20 ° C durante anos. </li></ol> 3. Immunostaining <ol><li> Dip slides em 0,2% Photo-Flo por 30 s. para remover o mel. Lâminas Lean Onuma borda, com a borda que descansa em uma toalha de papel, para remover residual Photo-Flo. </li><li> Dip slides em 1x TBS por 5 minutos para lavar. Retire o excesso de líquido, inclinando-se lâminas em uma borda, mas não deixá-los secar. </li><li> Lay lâminas fosco lado de cima, pipeta 300 mL TBS / BSA para o slide em toda a parte unfrosted do slide. </li><li> Incubar numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 15 min. (Grande recipiente de plástico forrado com água saturada toalhas de papel debaixo de uma placa de metal ou de plástico caixa de lâminas perfuradas com toalhas de papel saturados). </li><li> Escorra slides, descansando uma margem mais curta do slide em uma toalha de papel e inclinando-se o slide contra um apoio adequado (tal como um rack de tubo de ensaio). Não permita que a superfície para secar. </li><li> Imediatamente aplicar 80 ul de tampão de TBS / BSA contendo uma diluição adequada de anticorpo primário. Se o anticorpo é limitativo, utilizar 40 ul e uma lamela de 22 mm x 22. Para soro de coelho em bruto, este é, tipicamente, entre uma diluição de 1/50 e 1/500. NOTA:Realizar titulações para novas preparações de anticorpos. A preparação mais diluído que gera alto sinal acima do fundo é escolhido. Para controlar o nível de coloração de fundo, os núcleos devem ser preparados a partir da estirpe mutante de deleção adequada e / ou lâminas de duplicados devem ser coradas com soro pré-imune. </li><li> Coloque um polido 22 x 50 mm lamela na lâmina evitar bolhas. Faça isso, mantendo a lamela entre o polegar eo dedo indicador ao longo da borda longa em posições perto de uma margem curta. Segurando a lamela a um ângulo de 30 ° em relação ao deslize, o mais distante borda curta a partir dos dedos é reduzido até que repousa sobre a corrediça apenas no interior da borda do &quot;poça&quot; mais próximo da região fosco da corrediça. Em seguida, abaixe lentamente a lamela em um movimento suave até que os dedos segurando o toque de slides do banco, e depois solte. Não tente ajustar a posição da lamela uma vez ele cair. NOTA: Se os spreads de cromossomos foram preparadas noapostos lamelas (em vez de directamente sobre a superfície de lâminas), esta amostra lamela permanecerá fixada à corrediça ao longo dos passos de coloração e de lavagem. Uma lamela adicional será colocada em cima da lamela amostra para distribuir uniformemente a solução de anticorpo durante a coloração e, em seguida, descartado. </li><li> Colocar as lâminas em uma câmara de humidade selada e incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Segurando a borda transferência fosco os slides para um suporte de coloração lâmina de vidro e submergir em uma tina de coloração contendo TBS. </li><li> Delicadamente mergulhe o slide para cima e para baixo para remover a lamela. Tente não usar muita força para fazer isso. Lavar as lâminas 2x 10 min por submersão em TBS. Remover as lâminas da cremalheira e drenar o excesso de líquido, tocando a borda toalha de papel. Não deixe que a superfície seca. </li><li> Trabalhando sob luz difusa, imediatamente adicionar 80 ul TBS / BSA contendo um 1 / 1.000 diluição vezes de anticorpo secundário conjugado fluorocromo (ou 40 ul com uma lamela de 22 x 22 mm). De Anúnciosd lamela como antes e incubar a 4 ° C durante 2 horas na câmara húmida no escuro. </li><li> Remover lamelas como antes, drenar lâminas, e permita que a superfície secar ao ar durante 1-2 horas no escuro. Lâminas Lean On toalhas de papel como antes. NOTA: Se se espalhando foi realizada sobre uma lamela montado, retirar a lamela do diapositivo antes da secagem. As lamelas são em seguida secou-se como descrito para corrediças no passo anterior. </li><li> Trabalhando sob luz difusa, adicionar cerca de 30 ul de meio contendo DAPI (10 gotas três ul) de montagem e abaixe cuidadosamente a lamela. Se os spreads são em lamelas, coloque as gotas de meio de montagem sobre uma lâmina limpa e reduzir lamela, o lado do cromossomo para baixo, para o slide. </li><li> Ainda sob luz difusa, espere 2 minutos para lamela para se estabelecer e selar bordas da lamela com unha polonês claro. Colocar as lâminas em uma caixa de slides plana. NOTA: Para a microscopia STED, montagem com prolongar Gold. Use 30 ul de prolongar OuroDAPI e sem deixar curar durante a noite. Vedação com unha polonês é desnecessário. </li><li> Veja as lâminas de microscopia de epifluorescência widefield com 40 ou objetiva 100X, utilizando um filtro adequado para definir DAPI para se concentrar. Opcionalmente armazenar a corrediça no escuro a 4 ° C durante várias semanas. Não congelar. </li></ol>

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	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens para estudos de mecanismos moleculares de processos biológicos, incluindo o estudo de proteínas que controlam a função cromossoma. Embora existam vantagens bem conhecidas de brotamento de levedura para estudos genéticos, moleculares e bioquímicos, estudos citológicos da distribuição de proteínas no núcleo da célula é complicada pelo seu tamanho pequeno. O núcleo típico de levedura tem um diâmetro de menos de um micron, que é apenas cerca de 5 vezes o limite de resolução da luz visível. Assim, a quantidade de informação sobre a distribuição de proteínas nucleares que pode ser obtido a partir de imunocoloração convencional ou usando as marcas de proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP), é limitada. Uma abordagem útil para caracterizar a distribuição de proteínas é subnuclear superfície cromossoma espalhamento. Esta abordagem envolve a remoção da parede celular, interrompendo celular e membranas nucleares, e umllowing o conteúdo insolúveis do núcleo para assentar sobre a superfície de uma lâmina de microscópio. Estes componentes insolúveis incluem a matriz nuclear e os cromossomas. Além de permitir a remoção do conteúdo nuclear solúveis, o que aumenta a capacidade para detectar proteínas ligadas cromatina, o cromossoma espalhando método resulta em substancial descompressão dos cromossomas de modo a que os núcleos propagação têm diâmetros de cerca de 3 a 5 um (para os núcleos diplóides meióticas) e 2 a 3 mm para núcleos diplóides mitóticas. Isto permite a detecção de descompressão subestrutura nuclear que é relativamente difícil ou impossível de resolver em núcleos intactos. Uma desvantagem óbvia no cromossoma de espalhamento é a possibilidade de que o processo de espalhamento podem parcialmente ou completamente perturbar a estrutura de interesse. Particularmente preocupante é que um cromossomo ligado proteína particular podem ser perdidos como consequência do processo de propagação. Esta complicação potencial should ser mantido em mente ao interpretar os dados. Um exemplo de uma proteína que é sensível ao procedimento de propagação é o beta-tubulina. Sob algumas condições, o fuso, o qual é composto principalmente de tubulina, é preservada durante o espalhamento 3. Visualização do fuso é frequentemente útil para encenar núcleos de interesse. No entanto, visualizando tubulina requer tratamento com um fixador de elevada concentração; fusos são perdidos sob as condições padrão descritas abaixo. Este exemplo ilustra que, quando se analisa a distribuição de uma proteína anteriormente não caracterizada, é importante variar a concentração do fixador para determinar a sensibilidade da proteína é referida variação. A despeito da preocupação com o impacto das condições de propagação em estrutura dos cromossomas, a utilidade e o método de alimentação de propagação tem sido demonstrada em muitos contextos e tem ampla utilidade na caracterização de mitose e, especialmente células meióticas 4-7. TwO espalhamento métodos têm sido utilizados extensivamente. O primeiro destes métodos, desenvolvidos pela Dresser Giroux e 8, evita a utilização de detergente e pode produzir preparações propagação que parecem ter morfologia cromossoma relativamente bem preservada quando coradas para o corante de DAPI-ADN específica. No entanto, este método é relativamente difícil e aperfeiçoar a qualidade dos núcleos propagação varia dramaticamente, quando uma região de uma corrediça é comparada com outras regiões. Este problema pode complicar abordagens quantitativas que envolvem imagiologia muitos núcleos não selecionados de um slide para evitar viés de aquisição de dados. O segundo cromossomo método espalhando, desenvolvido pela Loidl e Klein 1, envolve o equilíbrio de fixação por paraformaldeído, com lise e descompressão cromatina promovido por uma solução de detergente. Quando executado corretamente, este método dá resultados muito reprodutíveis com menos variação de região para região, em comparação com o método Dresser and Giroux. Esta apresentação se concentra em um modified versão do método de Loidl e Klein, por causa da sua fiabilidade e a simplicidade. Cromossoma propagação não é complicada ou demorada; até 100 lâminas pode ser preparado para a imunocoloração num único dia. Além disso, as preparações de propagação pode ser armazenado no congelador durante anos antes da imunocoloração, e, assim, laboratórios pode desenvolver um repositório de barrar cromossómicas congelados que podem ser usados ​​quando novas perguntas biológicos surgem novos reagentes de coloração ou tornar-se disponíveis. O método cromossoma espalhamento é mais comummente usado em combinação com imuno fluorescência e microscopia de campo amplo, mas também é possível preparar as lâminas de super-resolução métodos microscópicos de luz, tais como esgotamento de emissão estimulada microscopia (STED).

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

O aparecimento de propagação núcleos depende criticamente sobre o equilíbrio entre a fixação cromossomo e de compactação. Mesmo quando os reagentes são adequadamente equilibrado, variação no grau de cromossoma de compactação pode ocorrer em diferentes regiões da mesma lâmina e / ou entre as diferentes lâminas. Assim, a qualidade dos spreads em uma determinada região de um slide deve ser avaliada antes imagens são interpretadas. Os efeitos da &quot;asa&quot; e &quot;underspr...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K visualizações.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genética

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biologia

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Bioquímica

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Levedura Método Embedding Colony

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Imunologia e Infecção

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

Levedura Método Embedding Colony

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae