Name: surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOTA: Alcune fasi del protocollo di seguito richiedono che lavora in una cappa aspirante pulito. Inoltre, il metodo richiede un microscopio di dissezione lievito tetrad dotato di un obiettivo 10X distanza di funzionamento lunga monitorare spheroplasting. Il microscopio dovrebbe essere istituito nel cofano prima del tempo. Rimuovere il braccio micromanipolatore e portatarga dal campo di applicazione e inserire questi elementi in un luogo sicuro, lontano dalla zona di lavoro. 1. Preparazione di sferoplasti <ol><li> Crescere lievito in condizioni desiderate. Uso circa 2 x 10 8 cellule per ogni campione, ad esempio 4 ml di una coltura a OD600 = 1,4 5 x 10 7 cellule / ml. Sebbene trasformazione immediata di campioni può essere preferibile in alcuni casi, per la maggior parte delle applicazioni, aliquote di cellule possono essere conservate in ghiaccio per 8 ore prima di essere elaborato. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e di spin in una centrifuga clinica a fissare 5 (2345 giri / 857,5 xg) per 3 minuti per far sedimentare le cellule. </li&gt; <li> Decantare il mezzo facendo attenzione a non perdere le cellule dal pellet. Risospendere delicatamente le cellule in tampone ZK 1 ml e aggiungere 40 ml 1 M ditiotreitolo (DTT). Incubare 2 min con miscelazione delicata. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). </li><li> Pellet Risospendere nel buffer ZK 1 ml. Aggiungere 5 ml di una soluzione appena preparata di 100T zymolyase che è stato accuratamente miscelati. Incubare per 20-30 minuti a 30 ° C per rimuovere la parete cellulare e produrre sferoplasti. </li><li> Analizzare una goccia 10 ml di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio per determinare se spheroplasting è completa. Le cellule viste al microscopio dissezione senza un vetrino. Le cellule devono apparire gonfio e rotondo, piuttosto che un po &#39;allungata e dovrebbero lisare seguito all&#39;aggiunta di 20 ml di acqua. Se le cellule non riescono a lisare, restituire il campione a 30 ° C e ri-test ogni 10 minuti fino a quando l&#39;acqua indotta lisi è facilmente osservabili. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). </li><li> Risospendere delicatamente e lavare cellule pellet in 2,5 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). Risospendere delicatamente pellet di cellule in 300-400 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Le celle possono essere tenuti in ghiaccio in questa fase per diverse ore. </li></ol> 2. Diffondere Cromosoma NOTA: Le superfici di vetro su cui si diffondono, sia cromosomi diapositive o coprioggetto-dovrebbe essere preparata in anticipo. Ogni diapositiva o coprioggetto devono essere immersi in acqua, poi EtOH, poi lasciato asciugare e lucidato con carta per lenti. Se cromosomi saranno distribuite su vetrini, il vetrino deve essere apposto su un vetrino con nastro adesivo o mastice. Se non diversamente indicato, il resto del protocollo descriverà diffusione sia su un vetrino o coprioggetto <ol><li> Usando una pipetta P20, pipetta 20 ml di sospensione cellulare sulla superficie di un vetrino pulito. </li><li> Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 40 ml di PFA / soluzione di saccarosio 3% e mescolare delicatamente la solution da &quot;agitando&quot; il vetrino con la mano fino a quando le linee Schlieren scompaiono. Mettere vetrino sotto il microscopio e confermano che le cellule sono a fuoco. La soluzione PFA deve essere appena preparata nella cappa il giorno di utilizzo. NOTA: Se la proteina di interesse non è stato esaminato con il metodo precedentemente, è consigliabile preparare diapositive utilizzando soluzioni contenenti 2 e 4% PFA per determinare se la ritenzione della proteina è sensibile alle condizioni di fissazione. Una soluzione / di saccarosio 4% PFA viene utilizzato nei casi in cui è auspicabile visualizzare microtubuli di tubulina associati. Lo svantaggio della maggiore concentrazione fissativo è che i cromosomi saranno &quot;underspread,&quot; 2% PFA tende anche a produrre cromosomi &quot;underspread&quot;. </li><li> Usando una pipetta P200, aggiungere 80 ml di 1% Lipsol, agitare come prima per miscelare soluzioni più completamente possibile, avviare un timer. Se Lipsol non è disponibile, 80 microlitri 1% NP40 o 80 ml ​​dH 2 O possono esseresostituito (vedi Rappresentante dei risultati, figura 2). </li><li> Guarda con attenzione e delicatamente le cellule agitare il vetrino ogni 15 secondi. Quando circa l&#39;80% delle cellule ha lisato (scomparsi) fermare il timer, rimuovere immediatamente il vetrino da microscopio, aggiungere 80 ml di PFA / soluzione di saccarosio, e agitare per mescolare. Lysis dovrebbe verificarsi di tra 30 e 90 sec dopo aver avviato il timer. NOTA: Se più diapositive mostrano lisi a circa lo stesso tempo, si può eventualmente omettere monitoraggio microscopico per il resto delle diapositive e semplicemente il tempo accuratamente periodo tra aggiunta di lipsol e l&#39;aggiunta della parte aliquota finale del fissativo. Tuttavia, questa scorciatoia è affidabile soltanto durante la preparazione più diapositive dallo stesso campione. E &#39;meglio monitorare lisi di ciascun campione microscopicamente quando diverse diapositive sono preparati da campioni prelevati in momenti diversi o da culture diverse. </li><li> Posizionare il vetrino su una superficie piana e pulita e diffondere il liquido su tutta la surfac unfrostede della slitta con il lato di un pulito monouso pipetta pascolo tenuto sotto del menisco del &quot;pozza&quot;, ma al di sopra della superficie della slitta stessa, cioè. non &quot;rastrello&quot; la superficie del vetrino con la pipetta. Non riutilizzare pipetta su diapositive diverse per evitare la contaminazione dei campioni. </li><li> Lasciare i vetrini ad asciugare durante la notte nella cappa. Componenti nucleari insolubili si depositerà sulla superficie di scorrimento e si legano ad esso. Per grandi esperimenti, pianificare l&#39;uso dello spazio per la fase di asciugatura è importante. </li><li> Una volta essiccato, i risultati migliori si ottengono procedendo alla fase immunocolorazione lo stesso giorno. Tuttavia, la soluzione di saccarosio essiccato incorpora i cromosomi diffusione in un &quot;miele&quot; che permette congelamento dei campioni: vetrini possono essere trasferiti ad una cassa scorrevole plastica e conservati a -20 ° C per anni. </li></ol> 3. Immunostaining <ol><li> Immergere i vetrini in 0,2% Foto-Flo per 30 sec. per rimuovere il miele. Diapositive Lean Onun bordo, con il bordo di riposo su un tovagliolo di carta per rimuovere residui Photo-Flo. </li><li> Immergere i vetrini in 1x TBS per 5 minuti per lavare. Rimuovere il liquido in eccesso appoggiandosi diapositive su uno spigolo, ma non lasciarli asciugare. </li><li> Posare diapositive glassato lato alto, pipetta 300 ml di TBS / BSA sul vetrino attraverso la porzione unfrosted della diapositiva. </li><li> Incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 15 min. (Grande contenitore di plastica rivestito con acqua satura di tovaglioli di carta sotto una lastra di metallo o di plastica scivolo box traforata con tovaglioli di carta saturi). </li><li> Drain diapositive appoggiando una breve bordo del vetrino su un tovagliolo di carta e appoggiato la slitta contro un supporto appropriato (ad esempio un tubo cremagliera test). Non lasciare asciugare la superficie. </li><li> Applicare immediatamente 80 ml di tampone TBS / BSA contenente la diluizione appropriata di anticorpo primario. Se l&#39;anticorpo è limitante, utilizzare 40 ml e un coprioggetto mm 22 x 22. Per siero di coniglio greggio, questo è in genere tra una diluizione 1/50 e 1/500. NOTA:Eseguire titolazioni di nuovi preparati di anticorpi. La preparazione più diluita che produce segnale alto sopra sfondo è scelto. Per controllare il livello di colorazione di fondo, i nuclei devono essere preparati dal ceppo mutante di delezione appropriati e / o diapositive duplicati deve essere macchiato con siero pre-immune. </li><li> Posizionare un lucido 22 x 50 mm coprioggetto sul vetrino evitando bolle. A tale scopo, tenendo il vetrino tra il pollice e l&#39;indice sul lato lungo in posizioni vicino a uno lato corto. Tenendo il vetrino a 30 ° rispetto a scivolare, la breve lontano bordo dalle dita si abbassa fino ad appoggiarlo sul vetrino appena all&#39;interno del bordo della &quot;pozza&quot; vicino alla regione smerigliato della diapositiva. Poi abbassare lentamente il vetrino in un movimento fluido fino a quando le dita che reggono il tocco diapositiva in panchina, e poi rilasciarlo. Non tentare di regolare la posizione del vetrino, una volta che atterra. NOTA: Se spread cromosomiche sono stati preparati sucoprioggetto apposti (anziché direttamente sulla superficie di diapositive), questo campione coprioggetto rimarranno apposta sulla slitta durante la procedura di colorazione e lavaggio. Un vetrino supplementare sarà posto sulla parte superiore del vetrino campione per distribuire uniformemente la soluzione di anticorpi durante la colorazione e quindi scartato. </li><li> Posizionare i vetrini in una camera umida sigillata e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Tenendo il trasferimento bordo smerigliato i vetrini in una colorazione rack di vetrino e immergere in una vaschetta di colorazione contenente TBS. </li><li> Immergere delicatamente il vetrino su e giù per rimuovere il vetrino. Cercate di non usare troppa forza per farlo. Lavare le diapositive 2x 10 min immergendo in TBS. Togliere i vetrini dalla rastrelliera e drenare i liquidi in eccesso toccando bordo di un tovagliolo di carta. Non lasciare che la superficie asciutta. </li><li> Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere immediatamente 80 microlitri TBS / BSA contenente un 1 / 1.000 volte diluizione fluorocromo anticorpo secondario coniugato (o 40 ml con un coprioggetto 22 x 22 mm). Annunciod coprioggetto come prima e incubare a 4 ° C per 2 ore nella camera umida al buio. </li><li> Rimuovere coprioggetto come prima, scolare scivoli, e consentire superficie asciugare per 1 a 2 ore al buio. Diapositive Lean On asciugamani di carta come prima. NOTA: se la diffusione è stata eseguita su un vetrino montato, staccare il vetrino dalla diapositiva prima di asciugare. I vetrini vengono poi essiccati come descritto per diapositive nel passaggio precedente. </li><li> Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere circa 30 ml di mezzo contenente DAPI (tre 10 gocce microlitri) di montaggio e poi con attenzione abbassare un vetrino. Se gli spread sono su vetrini, posizionare le gocce di mezzo di montaggio su un vetrino pulito ed abbassare il vetrino, lato cromosoma verso il basso, sul vetrino. </li><li> Sempre sotto la luce soffusa, attendere 2 minuti per vetrino di stabilirsi e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. Mettere i vetrini in una scatola di guida piatta. NOTA: Per la microscopia STED, montare con Prolong oro. Utilizzare 30 ml di prolungare Orosenza DAPI e permettono di curare tutta la notte. Tenuta con smalto non è necessaria. </li><li> Lettura dei vetrini di epifluorescenza widefield con 40 o un obiettivo 100X utilizzando un set di filtri appropriati per DAPI per mettere a fuoco. Facoltativamente memorizzare il vetrino al buio a 4 ° C per diverse settimane. Non congelare. </li></ol>

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	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

Il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba offre numerosi vantaggi per gli studi di meccanismi molecolari di processi biologici, tra cui lo studio delle proteine ​​che controllano la funzione cromosoma. Anche se ci sono vantaggi ben noti di gemmazione di lievito per gli studi genetici, molecolari e biochimici, gli studi citologici della distribuzione delle proteine ​​nel nucleo della cellula è complicata dalla sua piccola dimensione. Il tipico nucleo lievito ha un diametro inferiore a un micron, che è solo circa 5 volte il limite di risoluzione di luce visibile. Pertanto, la quantità di informazioni sulla distribuzione delle proteine ​​nucleari che possono essere ottenuti da immunostaining convenzionale o utilizzando i tag proteine ​​fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP), è limitata. Un approccio utile per caratterizzare la distribuzione subnucleare delle proteine ​​è superficiale cromosoma diffusione. Questo approccio comporta la rimozione della parete cellulare, interrompendo cellule e membrane nucleari, ellowing il contenuto insolubili del nucleo di stabilirsi sulla superficie di un vetrino da microscopio. Questi componenti insolubili includono matrice nucleare e cromosomi. Oltre a consentire la rimozione del contenuto nucleari solubili, che aumenta la capacità di rilevare le proteine ​​legate alla cromatina, il cromosoma diffusione metodo comporta sostanziale decompressione dei cromosomi tale che i nuclei diffusione hanno diametri di circa 3 a 5 micron (per nuclei meiotica diploidi) e 2-3 micron per nuclei mitotico diploidi. Questo permette di individuare la decompressione di sottostruttura nucleare che è relativamente difficile o impossibile da risolvere nei nuclei intatti. Un difetto evidente al cromosoma diffusione è la possibilità che la procedura di diffusione può parzialmente o completamente distruggere la struttura di interesse. Di particolare interesse è che un particolare cromosoma vincolato proteina potrebbe essere perso come conseguenza della procedura diffusione. Questo potenziale shou complicazioneld essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Un esempio di una proteina che è sensibile alla procedura di diffusione è la beta-tubulina. In alcune condizioni, il mandrino, che è composto principalmente di tubulina, viene preservata durante lo spandimento 3. Visualizzazione del mandrino è spesso utile per mettere in scena i nuclei di interesse. Tuttavia, visualizzando tubulina richiede un trattamento con un fissatore alta concentrazione; mandrini sono persi nelle condizioni standard descritte di seguito. Questo esempio dimostra che, quando si analizza la distribuzione di una proteina precedenza uncharacterized, è importante variare la concentrazione di fissativo per determinare la sensibilità del proteina è a tale variazione. Nonostante la preoccupazione per l&#39;impatto delle condizioni di diffusione sulla struttura cromosomica, l&#39;utilità e la potenza del metodo di diffusione è stata dimostrata in molti contesti e ha un ampio programma di utilità nella caratterizzazione di mitotico e, in particolare le cellule meiotiche 4-7. Two metodi di diffusione sono stati ampiamente utilizzati. Il primo di questi metodi, sviluppato da Dresser and Giroux 8, evita l&#39;uso di detergenti e può produrre preparati diffusione che sembrano avere relativamente ben conservato morfologia dei cromosomi durante la colorazione per lo specifico DNA colorante DAPI. Tuttavia, questo metodo è relativamente difficile da perfezionare e la qualità dei nuclei spread varia drammaticamente, quando una regione di una diapositiva viene confrontato con altre regioni. Questo problema può complicare approcci quantitativi che coinvolgono l&#39;imaging molti nuclei non selezionati da una diapositiva per evitare distorsioni dei dati di acquisizione. Il secondo cromosoma metodo di diffusione, sviluppato da Loidl e Klein 1, comporta bilanciamento fissazione con paraformaldeide, con lisi e decompressione cromatina promosso da una soluzione detergente. Se correttamente eseguita, questo metodo dà risultati molto riproducibili con meno variazioni da regione a regione, rispetto al metodo Dresser and Giroux. Questa presentazione si concentra su un modified versione del metodo di Loidl e Klein, a causa della sua affidabilità e semplicità. Cromosoma diffusione non è complicato o che richiede tempo; fino a 100 vetrini possono essere preparate per immunocolorazione in un solo giorno. Inoltre, i preparativi di diffusione possono essere conservati in congelatore per gli anni precedenti al immunoistochimica, e quindi i laboratori in grado di sviluppare un archivio degli spread cromosomiche congelati che può essere utilizzato quando nuove questioni biologiche sorgono o nuovi reagenti di colorazione diventano disponibili. Il metodo cromosoma diffusione è più comunemente usato in combinazione con immunocolorazione e microscopia a fluorescenza widefield, ma è anche possibile preparare vetrini per super-risoluzione leggeri metodi microscopici quali l&#39;esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

La comparsa di nuclei di diffusione dipende in modo critico sul bilanciamento tra cromosomi fissazione e de-compattazione. Anche quando i reagenti sono correttamente bilanciati, variazione del grado del cromosoma de-compattazione può verificarsi in diverse regioni della stessa diapositiva e / o tra diverse diapositive. Pertanto, la qualità di spread in una data regione di un vetrino deve essere valutato prima immagini vengono interpretati. Gli effetti della &quot;invadendo&quot; e &quot;un...

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Ricerca

Genetica

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

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Biologia

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochimica

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Lievito Colony metodo di inserimento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Immunologia e infezioni

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine in lievito

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

Lievito Colony metodo di inserimento

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

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