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* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung eines Multiplex-Immunfluoreszenz-Antikörper-Panels für die DNA-Barcode-basierte Bildgebung von murinen FFPE-Melanomgeweben. Wir beschreiben auch eine Bildanalyse-Pipeline mit Open-Source-Tools zur Generierung von räumlichen Proteomik-Einblicken in die Immunmikroumgebung des Mausmelanomtumors.
Vorgestellt wird eine aufstrebende DNA-Barcode-basierte Multiplex-Bildgebungstechnik, die auf Co-Detection-by-indEXing basiert und die räumliche Proteomik von Gewebemikroumgebungen analysiert. Für eine erfolgreiche Bildgebung ist ein Repertoire an gut konzipierten und ordnungsgemäß validierten Antikörper-Panels erforderlich, aber für formalinfixierte paraffineingebettete (FFPE) Proben gibt es derzeit nur sehr wenige. FFPE bietet mehrere Vorteile gegenüber frisch gefrorenen Proben, wie z. B. die weit verbreitete Verfügbarkeit, die einfache Handhabung und Lagerung sowie die Möglichkeit, Gewebe-Microarrays (TMAs) herzustellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung eines Antikörper-Panels zur Visualisierung und Analyse von FFPE-Geweben aus einem murinen Melanommodell vor, das mit Nanopartikeln behandelt wurde, die Plasmid-DNA liefern, die für immunologische Signale für die Reprogrammierung der Tumormikroumgebung kodiert. Wir beschreiben auch eine Bildanalyse-Pipeline mit Open-Source-Computerwerkzeugen für die Annotation von Geweben, die Segmentierung von Zellen, die Verarbeitung von Proteomik-Daten, die Phänotypisierung von Zellpopulationen und die Quantifizierung räumlicher Metriken. Das Protokoll bietet Anwendungen für das Design von Antikörper-Panels in muriner FFPE und die Generierung neuer Einblicke in die räumliche Proteomik komplexer Gewebemikroumgebungen.
Das kutane Melanom ist der häufigste Hautkrebs mit weltweit unterschiedlichen Krankheits- und Sterblichkeitsraten, je nach Zeitpunkt der Diagnose und der Primärversorgung1. In den letzten zehn Jahren hat ein verbessertes biologisches Verständnis des Melanoms dazu beigetragen, die Entwicklung neuer Krebsmodelle zur Behandlung solider Tumore voranzutreiben2. Das jüngste Aufkommen der Immuntherapie hat zu einem revolutionären Konzept der Krebsbehandlung geführt, das auf der Aktivierung des endogenen Immunsystems basiert 3,4.
Die Tumormikroumgebung (TME) ist hochkomplex und besteht aus verschiedenen Immunzellen, krebsassoziierten Fibroblasten, Perizyten, Endothelzellen und verschiedenen geweberesidenten Zellen5. In der Vergangenheit wurden verschiedene Techniken zur Untersuchung der TME angewendet, wie z. B. die Durchflusszytometrie und die Einzelzellsequenzierung, die den räumlichen Kontext beeinträchtigen, da sie zur Zerstörung des Tumorgewebes erforderlich sind. Traditionelle mikroskopische Bildgebung wie Immunfluoreszenz (IF) und Immunhistochemie (IHC) ermöglichen die Visualisierung von Protein-Biomarkern, ohne das Probengewebe zu zerstören. Diese Ansätze sind jedoch auf zwei oder drei Biomarker beschränkt und können kein vollständiges Verständnis der räumlichen und strukturellen Zusammenhänge innerhalb des Komplexes TME 6 liefern.
Um dieses Problem zu lösen, wurden mehrere Multiplex-Bildgebungsverfahren entwickelt, um die komplexe TME räumlich sichtbar zu machen 7,8,9,10. Eines davon ist CoDetection-by-inDEXing, umbenannt in PhenoCycler-System, das auf DNA-Oligonukleotid-konjugierten Antikörpernbasiert 11. Das System kann die Einzelzellbildgebung und die Analyse von über 100 Biomarkern für menschliche Proben ermöglichen. Es stehen jedoch nur sehr wenige inventarisierte Antikörper zur Verfügung, um murine Proben zu visualisieren und zu analysieren, insbesondere Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Proben12. FFPE bietet mehrere Vorteile gegenüber der Konservierung von Fresh Frozen (FF), wie z. B. eine einfache Handhabung und Lagerung, eine gut erhaltene Morphologie im Laufe der Zeit und vor allem die Möglichkeit, Gewebe-/Tumor-Microarrays (TMA) herzustellen, die die Visualisierung mehrerer Proben auf einem einzigen Objektträger ermöglichen. Wir haben kürzlich ein murines FFPE CODEX/PhenoCycler-Antikörperpanel entworfen und entwickelt und es erfolgreich eingesetzt, um die räumliche Proteomik von genetisch reprogrammierten murinen Melanomproben zu visualisieren und zu analysieren13.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design eines murinen FFPE-Antikörper-Panels bereitzustellen und den Prozess der Antikörper-Barcode-Konjugation, der Gewebefärbung und der Bildgebung zu beschreiben. Darüber hinaus stellen wir eine detaillierte Bildanalyse-Pipeline vor, die Open-Source-Tools wie QuPath und R-Pakete verwendet. Nach dem Befolgen dieses Protokolls lernen die Forscher, wie sie ein individuell konjugiertes Antikörperpanel entwerfen, Multiplex-Bildgebung mit einem Phenocycler-Fusion-Gerät durchführen und neue Einblicke in die räumliche Proteomik des Melanom-TME gewinnen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angepasst werden, um verschiedene Mikroumgebungen des Tumorimmungewebes zu untersuchen und mit bestehenden räumlichen Transkriptomik-Techniken kombiniert zu werden.
Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Johns Hopkins Animal Care and Use Committee unter Verwendung der genehmigten Protokollnummern MO18M388 und MO21M384 durchgeführt.
1. Auswahl der Antikörper
2. Antikörperkonjugation und -bestätigung
3. Vorbereitung der FFPE-Proben aus Murine
4. FFPE-Gewebefärbung und Bildgebung
5. Gewebeannotation und Zellsegmentierung
6. Vorverarbeitung und Normalisierung von Proteomik-Daten
7. Clustering und Phänotypisierung
8. Neuzuordnung von Phänotyp-Klassifikationen und Durchführung von Qualitätskontrollen
9. Dichtequantifizierung und räumliche Analyse
Hier stellen wir ein Protokoll für das Design eines Antikörper-Panels für murines FFPE-Gewebe, die Durchführung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung und die Analyse von Bildern für die Proteomik-Quantifizierung und räumliche Beziehungen vor. Das validierte Panel enthält 27 Antikörper, die Marker für die Visualisierung von Melanomzellen (SOX10), Leukozyten (CD45), T-Zellen (CD3, CD4, CD8, FOXP3), B-Zellen (CD20), Makrophagen und Subtypen (F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206), dendritischen Zellen (CD11c), NK-Zellen (NK1.1) und Endothelzellen (CD31) liefern. Das vollständige Panel enthält auch Marker für andere Immunpopulationen (CD11b, CD38), Proliferationsaktivität (Ki67), T-Zellfunktionalität (T-bet, Eomesodermin, Granzym B), Antigenpräsentation (LMP2, Beta-2-Mikroglobulin, MHC II) und Checkpoint-Expression (TIM3, LAG3, PD-L1)12. Ein repräsentatives Bild der Gelelektrophorese bestätigt die erfolgreiche Konjugation von DNA-Oligonukleotid-Barcodes an die trägerfreien Antikörper, wie in Abbildung 4 dargestellt. Dieser Schritt bestätigt nur die chemische Reaktion, und die Bildbestätigung kann erst erfolgen, nachdem diese Antikörper mit dem Multiplex-Bildgebungsgerät am interessierenden Gewebe überprüft wurden. In der folgenden Referenz finden Sie validierte Bilder aller 27 Marker in Panel13. Abbildung 5 zeigt ein Fusionsbild der wichtigsten Linienmarker, die drei murine Melanom-Gewebeschnitte färben, die mit intratumoralen 4-1BBL/IL-12-Nanopartikel-Injektionen und systemischem Anti-PD1 behandelt wurden. Diese Schnitte wurden für die anschließende Bildanalyse in diesem Protokoll verwendet.
Nach der Gewebeannotation, der Zellsegmentierung und der Vorverarbeitung der Proteomikdaten präsentieren wir einen Vergleich zwischen zwei Clustering-Algorithmen, die zuvor für die transkriptomische und/oder proteomische Einzelzellanalyse angewendet wurden17,18. Expressionsprofile für phänotypisierte Populationen sind in Abbildung 6 für beide Ansätze dargestellt. Wir zeigen, dass FlowSOM einen breiteren Bereich von Intensitätswerten (~0,7 vs. ~0,5) bietet, um Unterschiede zwischen ähnlichen Zellpopulationen, wie z.B. Makrophagen-Subtypen, zu erkennen. Seurat wandte den Louvain-Algorithmus während des Clusterings an und generierte 29 Cluster (Ergänzende Abbildung 1). Im Vergleich dazu verwendete FlowSOM selbstorganisierende Karten und kann 100 Cluster generieren (Ergänzende Abbildung 2). Eine größere Anzahl von Clustern führt zu mehr Zeit, die für die Phänotypisierung benötigt wird, aber dieser letztgenannte FlowSOM-Ansatz bietet auch mehr Nuancen bei der Klassifizierung ähnlicher Zellpopulationen. Qualitativ sehen wir, dass FlowSOM in der Lage war, mehr intratumorale Makrophagen entweder als M1- oder M2-Subtyp zu klassifizieren, verglichen mit der Seurat-Phänotypisierung im gleichen Sichtfeld (Abbildung 7). Das gleiche Ergebnis zeigt sich bei der Quantifizierung der Makrophagendichten, wobei FlowSOM im Vergleich zu Seurat eine höhere Dichte sowohl von M1- als auch von M2-Makrophagen erfasst (Abbildung 8A-B) und anschließend eine signifikant geringere Dichte anderer/nicht klassifizierter Makrophagen (p = 0,0028; Abbildung 8C). Nichtsdestotrotz lieferten die beiden Analyseansätze auch bei der Beschreibung anderer Zellpopulationsdichten wie CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen und Endothelzellen ähnliche Ergebnisse (Abbildung 8D-F).
Wir präsentieren auch die Ergebnisse der nachgelagerten räumlichen Analyse nach Clustering und Phänotypisierung. Abbildung 9 zeigt einige der räumlichen Metriken, die mit diesem Protokoll generiert werden können. Bezogen auf alle phänotypisierten Populationen wiesen M2-Makrophagen und NK-Zellen nach Behandlung mit 4-1BBL/IL-12-Nanopartikeln und Anti-PD1 die höchsten AMDs auf (Abbildung 9A). In ähnlicher Weise war die NMS zwischen intratumoralen CD8-T-Zellen und M1-Makrophagen viel höher als zwischen CD8-T-Zellen und M2-Makrophagen (Abbildung 9B). Darüber hinaus trugen M2-Makrophagen ~1% in der 100-μm-Nachbarschaft bei, die intratumorale CD8-T-Zellen umgibt, während M1-Makrophagen 9%-13% dieser Nachbarschaften ausmachten (Abbildung 9C). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das 4-1BBL/IL-12-Behandlungsschema tumorassoziierte Makrophagen in Richtung eines M1-Subtyps polarisierte und M2-Makrophagen aus der immunen Mikroumgebung des Tumors ausschloss.
Abbildung 1: Zusammenfassung des Arbeitsablaufs für die FFPE-Gewebefärbung und -bildgebung. Maus-FFPE-Gewebe wurden mit Vorfärbeverfahren verarbeitet, die mit dem Einbrennen des Gewebes über Nacht begannen, bevor mit der zweitägigen Vorfärbung (Tag 1) und der Nachfärbung (Tag 2) begonnen wurde. Abschließend wurde die Reporterplatte vorbereitet, bevor mit dem Gerät abgebildet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Screenshot der Gewebeannotation in der frei zugänglichen digitalen Pathologiesoftware QuPath. Die vollständige Gewebeannotation wurde gezeichnet (grün), dupliziert und minimiert, um das intratumorale Kompartiment entsprechend der Verteilung der SOX10+-Melanozyten an der Tumorgrenze (rot) zu definieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zellsegmentierung mit dem StarDist-Algorithmus in QuPath und Qualitätskontrollprozess zur Überprüfung von Phänotyp-Klassifikationen. (A) Navigieren Sie zur Registerkarte Bild, um die Pixelbreite und -höhe des Multiplex-Immunfluoreszenzbildes zu bestimmen. (B) Doppelklicken Sie nach der Neuzuordnung der Klassifikationen auf eine beliebige Zelle (wird gelb hervorgehoben), um die Clusterzuordnung und den Phänotyp anzuzeigen. Schalten Sie die Panel-Markierungen ein/aus, um zu bestimmen, ob dieser Klassifizierungsansatz korrekt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentatives Gelbild der Bestätigung der Antikörper-DNA-Barcode-Konjugation. Die Protein-Gel-Elektrophorese bestätigt die Antikörperkonjugation mit DNA-Oligonukleotid-Barcodes, die durch zusätzliche Banden an der Stelle der schweren Kette beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: DNA-Barcode-basierte Multiplex-Bildgebung von B16F10-Flankentumoren, die mit intratumoralen Injektionen von 4-1BBL/IL-12-Nanopartikeln mit systemischem Anti-PD1 behandelt wurden. Marker in unserem Panel nicht gezeigt: CD11b, CD20, CD38, TIM3, LAG3, T-bet, Eomesodermin, Granzym B, Ki67, LMP2, Beta-2-Mikroglobulin, MHC II, PD-L1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Proteomik-Expressions-Heatmaps von phänotypisierten Zellpopulationen. (A) Der Seurat-Clustering- und Phänotypisierungsansatz erzeugt einen etwas kleineren Bereich von Markerexpressionswerten im Vergleich zu (B) FlowSOM-Clustering und Phänotypisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Die FlowSOM-Phänotypisierung identifiziert eine größere Bandbreite verschiedener Makrophagen-Subtypen. Der obere Bereich zeigt die Makrophagen-Phänotypisierung von Seurat (links) und FlowSOM (rechts) für dasselbe Sichtfeld. Der untere Bereich zeigt Multiplex-Immunfluoreszenzbilder von wichtigen Markern der Makrophagen-Abstammungslinie im selben Sichtfeld. Alle Maßstabsleisten sind 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Vergleich der intratumoralen Dichten verschiedener Zellpopulationen nach Clustering/Phänotypisierung. Dichtevergleiche werden für intratumorale (A) M1-Makrophagen, (B) M2-Makrophagen, (C) andere Makrophagen, (D) CD4-T-Zellen, (E) CD8-T-Zellen und (F) Endothelzellen gezeigt. Bei den Fehlerbalken handelt es sich um Standardfehler des Mittelwerts (SEM), und die Signifikanz wurde mit ungepaarten t-Tests (**p ≤ 0,01) getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Profilierung intratumoraler räumlicher Metriken für Dreiflankentumoren, die mit intratumoralen 4-1BBL/IL-12-Nanopartikel-Injektionen und systemischem Anti-PD1 behandelt wurden. (A) Heatmap der durchschnittlichen Mindestabstände zwischen intratumoralen phänotypisierten Populationen. Die Messungen erfolgen in μm. (B) Normalisierte Mixing-Scores zwischen wichtigen intratumoralen Phänotyppaaren. (C) Aufschlüsselung der Zusammensetzung der Nachbarschaft in einem Radius von 100 μm um intratumorale CD8-T-Zellpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Antikörper | Verdünnung | Belichtungszeit (ms) |
SOX-10 | 50 | 450 |
CD8 | 100 | 450 |
CD3 | 100 | 450 |
FoxP3 | 50 | 350 |
CD4 | 50 | 450 |
MHC-II | 100 | 450 |
PDL1 | 50 | 450 |
CD45 | 100 | 450 |
Ki-67 | 100 | 300 |
F4/80 | 100 | 150 |
CD20 (Englisch) | 100 | 450 |
NK1.1/CD161 | 50 | 450 |
Nr. CD206 | 100 | 450 |
CD68 | 100 | 450 |
Granzyme-B | 50 | 450 |
CD86 | 100 | 150 |
CD31 | 100 | 450 |
CD11C | 50 | 450 |
CD11b | 50 | 450 |
EOMES | 50 | 450 |
TIM-3 | 50 | 300 |
CD38 | 50 | 200 |
LAG3 | 50 | 450 |
Nr. CD163 | 50 | 200 |
T-Wette | 50 | 300 |
LMP2-Liga | 100 | 100 |
Beta2 MG | 200 | 50 |
Tabelle 1: Einstellungen für Antikörperverdünnung und Expositionszeit.
Ergänzende Abbildung 1: Anfängliche Heatmap der Proteomik-Expression, die nach dem Seurat Clustering erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Anfängliche Heatmap der Proteomik-Expression, die nach dem FlowSOM-Clustering erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Der Erfolg der Bildgebung hängt von einem gut konzipierten und validierten Antikörperpanel ab. Die Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung von FFPE-Proben stellt aufgrund der hohen Autofluoreszenz und der Schwierigkeit, Epitope zu gewinnen, die durch Paraffineinbettung maskiert sind, eine Herausforderung dar. Da FFPE jedoch mehrere Vorteile im Vergleich zu FF-Proben bietet, ist es unerlässlich, FFPE-Antikörper-Panels zu entwerfen und zu validieren. Die Fertigstellung der Antikörperklon, die während der Immunfluoreszenz (IF)-Bildgebung positive Signale zeigen, ist der erste Schritt. Anschließend ist es wichtig, diese sorgfältig mit DNA-Barcodes zu konjugieren. Die Antikörperkonjugation erfordert eine teilweise Reduktion des Antikörpers, um SH-Bindungen zu erzeugen, die während der Maleimidgruppenreaktion mit einem Barcode verwendet werden. Nicht jeder Antikörperklon kann diesem Schritt standhalten, und einige Reaktionen können den Antikörper irreversibel schädigen, was trotz erfolgreicher Konjugation zu einem Versagen der Bildgebung führt. Auch wenn einige Antikörper während der konventionellen IF-Validierung positive Signale zeigen können, ist es aus diesem Grund wichtig, jeden Antikörper an dem tatsächlich interessierenden Gewebe zu validieren und die gewünschten Expositionszeiten für dieses Gewebe aufzuzeichnen, auch wenn einige Antikörper während der konventionellen IF-Validierung positive Signale zeigen können. In zukünftigen Anwendungen kann diese Technik mit bestehenden räumlichen Transkriptomik-Analysen auf aufeinanderfolgenden Objektträgern/demselben Objektträger kombiniert werden, um zusätzliche Erkenntnisse zu gewinnen. Eine der Einschränkungen dieser Methode besteht darin, dass sie eine sorgfältige Auswahl und Validierung jedes Antikörpers im Panel auf der Grundlage des Ziels und der Art des Gewebes erfordert.
In Bezug auf die Bildanalyse bietet QuPath ein wertvolles Open-Access-Tool mit hochwertiger Visualisierung von Proteomik-Markern, breiter Funktionalität für den Export von Intensitätsmessungen und die Durchführung von Qualitätskontrollen für Phänotyp-Klassifizierungen sowie eine gute Flexibilität für benutzergenerierte Skripte. Online-Foren wie https://forum.image.sc/ sind eine zusätzliche Ressource, um zu diskutieren, wie bestimmte Analyseaufgaben ausgeführt werden können, und um Skripte mit anderen Benutzern zu teilen. In diesem Protokoll vergleichen wir zwei Clustering- und Phänotypisierungsansätze mit Seurat und FlowSOM. Während FlowSOM aufgrund seiner Fähigkeit, detailliertere Einblicke in Immunzell-Subpopulationen des TME zu gewinnen, bevorzugt werden kann, muss auch die für die Proteomik-Analyse erforderliche Zeit berücksichtigt werden. Die Generierung von 100 Clustern kann unnötig sein, wenn ein Benutzer nur Zellen innerhalb einer oder zwei Gewebeproben phänotypisieren muss. In diesen Situationen kann Seurat eine schnellere und effizientere Pipeline für die Bildanalyse bieten. Im Gegensatz dazu ist es bei beiden Analyseansätzen wahrscheinlicher, dass die Analyse einer TMA mit mehr als 40 oder 50 Gewebeschnitten eine größere Anzahl von Zellclustern erzeugt, und FlowSOM kann die bevorzugte Methode zur Generierung nuancierterer Phänotyp-Klassifikationen sein.
Die Zellclusterbildung/Phänotypisierung und alle nachfolgenden Schritte der Bildanalyse hängen weitgehend von der Zellsegmentierung ab. Unsere aktuelle Arbeit hat die Zellsegmentierung in den Algorithmen HALO (Indica Labs) und StarDist untersucht, und wir haben festgestellt, dass beide Ansätze dazu neigen, Zellen basierend auf nukleären DAPI-Signalen zu übersegmentieren. Es stehen auch viele alternative Segmentierungsalgorithmen zur Verfügung, wie z. B. Mesmer19 und InstanSeg20. Dies ist ein wachsendes Feld der computergestützten Forschung, das weitere Untersuchungen und Optimierungen erfordert.
J.C.S. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung von Emerson Collective LLC und den National Institutes of Health. J.J.G. bedankt sich auch für die Finanzierung durch die National Institutes of Health. J.C.S. unterhält eine Beziehung zu Palleon Pharmaceuticals Inc., die Finanzierungszuschüsse beinhaltet. S.Y.T. und J.J.G. haben eine Beziehung zu OncoSwitch Therapeutics, die Aktien oder Aktien umfasst. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. und K.M.L. haben ein angemeldetes Patent. Alle anderen Autoren geben an, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die als Einfluss auf die in dieser Arbeit vorgestellte Forschung wahrgenommen werden könnten.
J.C.S. dankt der Dermatology Foundation und dem Dermatopathology Career Development Award für die Förderung der Karriere des Autors. Die Autoren danken Hsin-Pei Lee vom Cancer Data Science Laboratory des National Cancer Institute für die Unterstützung bei computergestützten Analysetechniken. Diese Forschung wurde vom Emerson Collective und den National Institutes of Health (R37CA246699, P41EB028239 und R01CA228133) finanziert. Darüber hinaus wird der Kern der Johns Hopkins Oncology Tissue Services (OTS) von den National Institutes of Health (P30CA006973) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | PN# 15710 | Required during tissue staining process |
50kDa MWCO filter | Millipore | UFC505096 | 25 kDa and 100 kDa result in failure |
Akoya barcodes and reporters | Akoya Biosciences | Varied | Each barcode can be used to conjugate 50 ug of carrier free antibody and comes with two vials of reporters |
Antibody conjugation kit | Akoya Biosciences | 7000009 | A conjugation kit is used to create custom barcode-conjugated antibodies. Each kit contains sufficient reagents for ten conjugations. The kit consists of one subkit box stored at 4 °C and one subkit box stored at -20 °C. The 4 °C subkit includes Filter Blocking Solution, Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, and Antibody Storage Solution. The -20 °C subkit includes Reduction Solution 1. |
Beta2MG | Abcam | ab214769 | |
CD11b | CST | #41028 | |
CD11C | CST | #39143SF | |
CD163 | CST | #68922BF | |
CD20 | CST | #45839 | |
CD206 | CST | #87887 | |
CD3 | CST | #24581 | |
CD31 | CST | #92841 | |
CD38 | CST | #68336BF | |
CD4 | Abcam | ab271945 | |
CD45 | CST | #98819 | |
CD68 | CST | #29176 | |
CD8 | Invitrogen | #14-0808-82 | |
CD86 | CST | #20018 | |
Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
EOMES | Abcam | ab222226 | |
Eppendorf PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | Required store 5 μL conjugated antibody for conjugation confirmation by gel electrophoresis |
Ethanol 200 proof | |||
F4/80 | CST | # 25514 | |
FoxP3 | CST | #72338 | |
Gran-B | CST | #79903SF | |
Heating oven | |||
Hybridization chamber | Used to stain tissue with antibody cocktail | ||
Hydrogen peroxide | Sigma | #216763 | Required for preparing bleaching solution |
Instant pot pressure cooker or Decloaking Chamber ARC | Instant pot or Biocare Medical | ||
Ki-67 | Akoya Biosciences | ||
LAG3 | CST | #80282BF | |
LMP2 | Abcam | ab243556 | |
Methanol | |||
MHC-II | eBioscience | #14-5321-82 | |
NK1.1 | CST | #24395SF | |
Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
PDL1 | CST | #85095 | |
Salmon Sperm DNA, sheared (10 mg/mL) | Invitrogen | AM9680 | Can be used as an alternative to assay reagent (Akoya) during reporter plate preparation step. |
SOX-10 | Abcam | ab245760 | |
Staining kit for PhenoCycler-Fusion | Akoya Biosciences | 7000017 | The PhenoCycler-Fusion Sample Kit includes the buffers and reagents necessary for tissue staining using antibodies conjugated with PhenoCycler barcodes, along with flow cells for whole-slide imaging. Each kit is sufficient for 10 PhenoCycler-Fusion experiments. It consists of one subkit stored at 4 °C, another at -20 °C, and a package of 10 flow cells kept at room temperature. The subkit stored at 4 °C contains Hydration Buffer, Staining Buffer, Storage Buffer, N Blocker, and J Blocker. The subkit stored at -20 °C contains G Blocker, S Blocker, and Fixative Reagent. |
T-bet | CST | #53753 | |
TIM-3 | CST | #72911 | |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | Required to dissolve barcodes during antibody conjugation |
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